Die Wirkung von Na+/H+-Austauscher-Inhibitoren auf die Infarktgröße nach Ischämie/Reperfusion am Schweineherzen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es am Schweinemodell in vivo die kardioprotektive Wirkungder Inhibition der myokardialen Natrium-Protonen-Austauscher (NHE1) mit denneuen pharmakologischen Blockern BIIB513 und BIIB722 sowie den dazugehörigenWirkungsmechanismus zu untersuchen und mit der ischämischen Präkonditionierungzu vergleichen. Hierzu wurden die NHE1-Inhibitoren sowohl systemischals auch über feine Nadeln lokal-intramyokardial verabreicht und eine 60 oder 90minütige Ischämie induziert, indem der Ramus interventricularis paraconalis derlinken absteigenden Koronararterie (LAD) reversibel okkludiert wurde. Es folgtejeweils eine 60 minütige Reperfusion. Bei der Kontrollgruppe zeigte sich nach 60minütiger Ischämie eine Infarktgröße (IS) von 61,1%. Die systemischeVerabreichung von BIIB513 reduzierte diese auf 43,1% (1,5mg/kg). Beisystemischer BIIB722-Applikation verringerte sie sich auf 41,4% (1,5mg/kg) und40,0% (3mg/kg) (p < 0,05). Die NHE1-Blockade zeigte auch bei intramyokardialerApplikation eine lokal-anti-nekrotische Wirksamkeit, indem das Myokard imInfusionsgebiet der Nadeln vor der Infarktentstehung geschützt blieb. Im Vergleichmit der NHE1-Inhibition zeigte die ischämische Präkonditionierung eine etwagleich starke Infarktgröße-reduzierende Effizienz. Das Präkonditionierungsprotokollvon jeweils zwei Zyklen einer 10 minütigen Ischämie und 10 minütigerReperfusion reduzierte die Infarktgröße auf 31%. Außerdem wurde gezeigt, daß beieiner Verlängerung der Ischämiedauer auf 90 Minuten die NHE1-Inhibierung keineInfarktgröße-verringernde Wirkung mehr hatte. Im weiteren Verlauf der Studie wurde, im Hinblick auf den Vergleich der beidenWirkungsmechanismen der NHE1-Inhibierung und der ischämischenPräkonditionierung, die Rolle der ATP-abhängigen Kaliumkanäle (KATP-Kanäle)und der p38-MAPK bei der NHE1-Inhibierung untersucht. Diesbezüglich findet sichin der Literatur, daß innerhalb der Signaltransduktionskette der ischämischenPräkonditionierung eine Aktivierung der KATP-Kanäle und eine Inhibierung derp38-MAPK stattfindet 131,266,274. Hierfür wurde eine simultane Blockade der KATP-Kanäle während der BIIB722vermittelten NHE1-Inhibition erzeugt. Es wurden jeweils die pharmakologischenKATP-Kanal-Blocker Glibenclamid und 5-Hydroxydecanoat systemisch verabreichtund gleichzeitig BIIB722 intramyokardial infundiert. Der BIIB722-vermitteltelokal-anti-nekrotische Myokardschutz blieb erhalten. Dies spricht dafür, daß eineAktivierung der KATP-Kanäle innerhalb des Schutzphänomens der NHE1-Blockadenicht stattfindet. Zudem wurde mittels einer Western-Blot-Analyse die phosphorylierte Form derp38-MAPK (P-p38-MAPK) in der zytosolischen Fraktion von Gewebeproben vonTieren bestimmt, welche nach einer Vorbehandlung mit BIIB722, zu denZeitpunkten eines funf-, zehn- und 15 minutigen LAD-Verschlusses aus demIschamiegebiet des linken Ventrikels entnommen wurden. Bei Kontrolltieren ergabsich ein mit zunehmenden Dauer der Ischamie ansteigender P-p38-MAPK-Gehalt,welcher nach zehn minutiger (323,2%) und 15 minutiger Ischamie (489,1%) imVergleich zu praischamisch entnommenen Kontrollbiopsien des unstimuliertenMyokards (100%) signifikant war (p ? 0,05). Die Untersuchung des Phosphorylierungsstatusder p38-MAPK bei Ischamie unter dem Einfluß der NHE1-Inhibierung, ergab hingegen nur eine verhaltene Zunahme zu Beginn der Ischamieund zeigte im Verlauf keinen weiteren Anstieg. Nach zehn Minuten zeigte sich dermaximale Gehalt der P-p38-MAPK bei 158,3% (p < 0,05), welcher nach 15 Minutenwieder absank. Die P-p38-MAPK-Bande der mit BIIB722 behandelten Gruppe warsomit signifikant geringer im Vergleich zu dem Gehalt der P-p38-MAPK derKontrollgruppe (p < 0,05). Diese kardioprotektive p38-MAPK-Dephosphorylierungist somit beiden Schutzphanomenen gemeinsam. Untersuchte man dieunphosphorylierte Form der p38-MAPK, so zeigte sich anhand der gleich starkausgepragten Banden auf einer Hohe von 38 kDa ein gleichbleibender Gehalt derunphosphorylierten p38-MAPK. Die in der Literatur oftmals vertretene Hypothese, dass die ischamischePrakonditionierung und die Na+/H+-Austauscher-Inhibition nicht auf einemgemeinsamen Wirkmechanismus zuruckzufuhren sind, wird durch die Ergebnisseder vorliegenden Untersuchung bestatigt: Es wurde gezeigt, dass die pharmakologischeNHE1-Inhibition KATP-Kanal-unabhangig ist, wahrend die ischamischePrakonditionierung nachweislich eine KATP-Kanal-Aktivierung bewirkt. Die beidenPhanomene zeigten jedoch auch vergleichbare Effekte: Erstens eine gleich starkeInfarktgröße-reduzierende Effizienz bei 60 Minuten, welche zeitlich auf eine Stundebegrenzt und somit transient war und zweitens eine kardioprotektiveDeaktivierung der p38-MAPK. Diese Uberschneidungen sprechen fur Gemeinsamkeitendieser beiden Schutzmechanismen im Schweinemyokard. Interaktionenzwischen beiden Signalketten auf einer oder mehreren Ebenen sind somit denkbar. This study compared the cardioprotective efficacy of ischemic preconditioning (IP)and myocardial sodium-hydrogen-exchanger (NHE1) inhibition and examined theinteractions between NHE1-inhibition and IP. In a porcine model of left anteriordescending artery (LAD)-occlusion, either IP, produced by two cycles of 10-minuteLAD-occlusion and 10-minute of reperfusion, or one of the the new pharmacologicalinhibitors BIIB513 (1.5 mg/kg) and BIIB722 (1.5 and 3 mg/kg) were administeredbefore a 60-minute LAD-occlusion followed by one hour of reperfusion. BIIB722 wasalso tested in pigs treated with 90-minute ischemia and one hour of reperfusion.The infarct size (IS) was determined by TTC-staining and expressed as apercentage of the area at risk. Althrough both IP and the NHE1-inhibition producedcomparable and significant reductions in IS in the 60-minutes occlusion model,insignificant reduction in IS by BIIB722 was observed in the 90-minute occlusionsmodel. Compared with control animals (IS=61.1%), IP reduced the IS to 31%,BIIB513 (1.5 mg/kg) to 43.1% and BIIB722 (1.5 and 3 mg/kg) to 41.4% and 40.0%.Furthermore BIIB722 was also given via intramyocardial (50µM in NaCl/DMSO)microinfusion-needles into the prospective area at risk before a 60-minute ischemiafollowed by one hour of reperfusion. A marked myocardial protection was shown bythe presence of viable (TTC-stained) myocardium around microinfusion-needlesdelivering BIIB722 that was not seen around needles with solvent. Since IP was first described numerous factors such as the KATP-channel-activationand the p38-MAPK-pathway have been shown to contribute to its cardioprotectiveeffect. Pharmacologic inhibition of the KATP-channel has been shown to blockIP 266,274. Furthermore, p38-MAPK-stimulation, which is known to be the cause foraccelerated cell death, is inhibited by IP 131. To investigate whether IP and NHE1-Inhibition convey protection through distinct or similar mechanisms the role ofKATP-channel-activation and the p38-MAPK-pathway in NHE1-inhibition wereexplored. Despite the simultaneous systemic application of either Glibenclamide, asarcolemmal and mitochondrial KATP-channel-blocker or 5-Hydroxydecanoate (5-HD), a specific mitochondrial KATP-channel-blocker, the local-antinecrotic effect ofintramyocardial BIIB722-microinfusion was maintained. Apparently KATP-channelactivationdoes not occur during NHE1-Inhibition. Next the amount of dual-phosphorylated p38-MAPK (Thr180/Tyr182) wasmeasured by Western blot analysis during index ischemia that followed thesystemic infusion of BIIB722 or the solvent. The ventricular drill biopsies weretaken from nonischemic (control) and also from the ischemic myocardium at varioustimepoints of LAD-occlusion. In the solvent-treated group there was a significantincrease of phospho-p38-MAPK during ischemia with a maximum reached at 15minutes of occlusion (489.1%) compared with nonischemic myocardium (100%). TheBIIB722 treatment significant reduced the content of phospho-p38-MAPK ofmyocardium at 10-minute of ischemia (158.3% vs. 323.2% of solvent treated group).Thus, cardioprotective p38-MAPK-dephosphorylation, which also occured during IP,is a common mechanism of NHE1-inhibition and IP induced cardioprotection. Thecontent of nonphosphorylated p38-MAPK remained unchanged in solvent- andBIIB722 treated tissue. The results of these study support the hypothesis that the cardioprotective effects ofIP and NHE1-inhibition do not occur via identical pathways. The cardioprotectionby pharmacological NHE1-inhibiton appears to be independent of mitochondrialprocesses, while IP is at least partly mediated by mitochondrial KATP-channelactivation.On the other hand, both IP and NHE1-inhibition provide comparablecardioprotection against 60 minutes of myocardial ischemia and also both result ina deactivation of the detrimental p38-MAPK-pathway. Furthermore, NHE1-inhibition failed to protect the heart against a prolonged ischemic insult (90minutes), like it has been reported for the IP phenomenon. Thus, while thecardioprotective effects of IP and NHE1-inhibition in the pig myocardium are notmediated by identical pathways, there may still be some overlapping mechanismsor crosstalk between these pathways.