Untersuchungen zur Assoziation von SNPs in Kandidatengenen auf SSC13 mit QTL für Actinobacillus pleuropneumoniae-Resistenz beim Schwein

Abstract

Die Aufklärung der genetischen Grundlagen der Krankheitsresistenz gegenüber dem weltweit verbreiteten Pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae ist im Hinblick auf Tierschutz, Ökonomie und Vebrauchererwartung dringend notwendig. Assoziationsanalysen zu SNPs im Transferrin-Gen bzw. Untersuchungen zur Expression von Glykoproteinen oder Immunmarkern bei infizierten Schweinen wurden von verschiedenen Forschergruppen durchgeführt. Mit dem Respiratory Health Score wurde ein neues Bewertungsschema für die Schwere einer durch Actinobacillus pleuropneumoniae verursachten Lungenentzündung etabliert. In derselben Studie wurden Rassenunterschiede hinsichtlich der Krankheitsresistenz deutlich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, zur Aufklärung der der Krankheitsresistenz zugrundeliegenden Ursachen auf DNA-Ebene beizutragen. Zu diesem Zweck sollte mithilfe von SNPs in positionellen und funktionellen Kandidatengenen eine für Merkmale der Actinobacillus pleuropneumoniae-Resistenz durchgeführte QTL-Analyse verbessert und die Lokalisation putativer QTN eingegrenzt werden. Als Grundlage dieser Untersuchungen diente eine gut charakterisierte F2-Familie aus im Merkmal Actinobacillus pleuropneumoniae- Resistenz divergierenden Ausgangspopulationen der Rassen Hampshire und Deutsche Landrasse. Bei den 170 F2-Tieren wurden mittels Pyrosequenzierung jeweils die Genotypen für 7 SNPs aus den Kandiatengenen AHSG, IL12A, MYD88, TFRC und TF auf SSC13 bestimmt. QTL-Analysen für 17 klinische Merkmale und 5 eQTL wurden in drei Schritten mithilfe der Online-Applikation GridQTL durchgeführt. Als Grundgerüst dienten 9 Mikrosatelliten auf SSC13. In einem zweiten Schritt wurden die SNPs als zusätzliche Marker eingefügt und zuletzt als fixe Effekte betrachtet. Insgesamt ließen sich bis zu drei QTL-Bereiche auf SSC13 darstellen, die mit einem oder mehreren der untersuchten Phänotypen assoziiert waren. Durch die vorliegende Arbeit wurden: 1. Verbindungen zwischen dem untersuchten SNP in MYD88 und der RAB6B- bzw. UPK1B-Expression sowie zwischen dem untersuchten SNP in TF und der RAB6B Expression festgestellt. Diese weisen auf mögliche funktionale Zusammenhänge zwischen den beteiligten Genen hin; 2. Die Existenz und Lokalisation von QTL bestätigt. Hierzu zählen ein QTL bei 52 cM für die Transferrin-Expression sowie ein QTL bei 58 cM für die nach dem Respiratory Health Score (RHS) 50 am stärksten und 50 am wenigsten betroffenen Tiere; 3. Die Konfidenzintervalle einiger QTL verkleinert (RAB6B: QTL1; UPK1B, TF: QTL2), wodurch der Suchbereich für ein putatives QTN eingegrenzt wurde. Es konnte jedoch, trotz eines hohen Grades an Vorinformation, durch den verwendeten Kandidatengen-basierten Ansatz kein Rückschluss auf die genaue Lage eines QTN für Actinobacillus pleuropneumoniae-Resistenz im Transferrin-Gen oder in den anderen Kandiatengenen gezogen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind, durch die Erhöhung der Genauigkeit der QTL-Lokalisation von Nutzen für eine Fortsetzung der Suche nach den der Resistenz/Empfänglichkeit zugrundeliegenden DNA-Varianten. Die Erkenntnisse hinsichtlich der Beziehungen zwischen den betrachteten Genen untereinander liefern einen Beitrag zum Verständnis der Abwehrprozesse im Wirt bei der Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion. Auch im Hinblick auf die bevorstehende flächendeckende Renaissance der Zuchtwertschätzung mithilfe genomabdeckender SNP-Chips und daraus resultierende genomische Selektion beim Schwein sind die Ergebnisse von SNP-Studien wie der vorliegenden von Wert. Mathematische Modelle, die mit kalkulierten SNP-Effekten arbeiten, können umso besser feinjustiert werden, je besser die betrachteten SNPs charakterisiert sind. Zukünftig sollte daher insbesondere die Suche nach SNPs, deren Genotypen mit einem hohen Anteil phänotypischer Varianz assoziiert sind fortgesetzt werden, beispielsweise unter Nutzung verbesserter Kartierungsverfahren oder Versuchstierpopulationen mit einer höheren Anzahl informativer Meiosen. Elucidation of the genetic background of genetically determined disease resistance against the wide spread pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae is urgently needed, especially with regard to animal welfare, economic considerations and consumer expectations. Different researchers have presented association analyses concerning SNPs in the transferrin gene or examined the expression of glycoproteins and immune markers in infected pigs, respectively. Furthermore, the Respiratory Health Score, a new scoring system to assess the degree of Actinobacillus pleuropneomiae-induced pneumonia has been established recently. These authors have also depicted significant differences among populations of Hampshire and German Landrace pigs regarding the degree of disease after challenge with Actinobacillus pleuropneumoniae. The aim of the work at hand was to make a contribution to the discovery of factors influencing disease resistance on a DNA Level. In order to improve a QTL analysis for traits of disease resistance and for the further characterisation of the QTL found, SNPs in positional and functional candidate genes were identified. A well characterised F2 Family, built by crossing populations of the divergent breeds Hampshire and DL, served as a basis for the present investigation. 170 F2-animals were genotyped by pyrosequencing for 7 SNPs, chosen from the candidate genes AHSG, IL12A, MYD88, TFRC and TF on SSC13. QTL analysis was performed in three steps for 17 clinical traits and 5 Cis-eQTL using the online application GridQTL. Three different protocols for repeated QTL-analysis were used. In a first step, the newly described SNPs were included consecutively as extra markers into the set of microsatellites of the recent QTL analysis. In the following step, these SNPs were regarded as fixed effects. The outcome of both analyses was compared with the recent QTL-analysis without extra markers. Altogether, we identified up to three QTL Regions on SSC13 which were associated with one or several of the disease resistance traits analysed. The present data provide evidence for interactions between the newly identified SNP in MYD88 and RAB6B and UPK1B gene expression respectively. Also, an influence of the SNP in TF on altered RAB6B gene expression was found. Consequently, a functional connection between these genes can be assumed. Furthermore, confidence intervals of some QTL (RAB6B: QTL1; UPK1B, TF: QTL2) were scaled down, restricting the area of interest on the way to identify the QTN. The existence and localisation of a transferrin-eQTL at 52 cM and a QTL for the 50 most and 50 least affected animals according to the Respiratory Health Score, at 58 cM were confirmed. However, the chosen candidate gene approach did not improve mapping of the actual QTL in the region of the transferrin gene or the other candidate genes in a way that a conclusion to a QTN localisation could be drawn. Nevertheless, further search for DNA variants causing differences in resistance/susceptibility towards Actinobacillosis will profit from the more exact QTL localisations found. Also, the revealed connections between genes can be of use for better understanding the mechanisms of host defense during an Actinobacillus pleuropneumoniae infection. Furthermore, findings from SNP studies provide basic information for genomic breeding value estimations, as they improve mathematical calculations for SNP effects. The better the used SNPs are characterised, the higher the exactness of the calculated effects will be. Consequently, the search for SNPs whose genotypes are associated with a great amount of phenotypic variance should be continued in the future, possibly by use of improved mapping procedures or test populations offering informative meioses in a high quantity.