Gerichtete Mutagenese am Natrium-abhängigen Gallensäuretransporter Ntcp zur Bedeutung negativ geladener Aminosäuren als Natrium-Sensor

Abstract

Gallensäuren zirkulieren bei Säugern im enterohepatischen Kreislauf zwischen dem Darm,der Leber und der Galle. An der Leber der Ratte werden Gallensäuren durch dasNa+/Taurocholat cotransportierende Polypeptid (Ntcp) aus dem Portalblut in dieLeberparenchymzellen transportiert. Ziel dieser Untersuchungen war es, überMutagenesestudien am Ntcp funktionell notwendige, negativ geladene Aminosäuren in demProtein zu identifizieren und zu klären, ob diese an der Na+-Bindung des Proteins beteiligtsind. Durch Site-directed Mutagenese wurden, ausgehend von dem cDNA-Klon des Ntcp,Mutantenklone generiert, bei denen je eine von sieben negativ geladenen Aminosäuren,nämlich D24, E47, E89, D115, D147, E257 und E277 (fünf konservierte und zwei nichtkonservierte), durch ihre neutralen Amide ersetzt wurden. Bei heterologer Expression in X.laevis-Oozyten wurde die Funktionalität der Klone durch Messung der[3H]Taurocholataufnahme in die Zellen geprüft. Die drei Mutationen D24N, D115N undE257Q reduzierten die [3H]Taurocholataufnahme hochsignifikant. Diese Klone wurden nachMarkierung mit dem FLAG®-Tag durch Immunfluoreszenzmikroskopie auf ihre Präsenz inder Oozytenmembran untersucht. Von den drei waren die Mutanten D115N und E257Q in derOozyten-Oberfläche nachweisbar, während D24N dort fehlte. Dies zeigt, dass D24 zurkorrekten Membraninsertion des Proteins notwendig ist. Durch Variation der Na+-Konzentration im Medium wurde die Na+-Abhängigkeit der [3H]Taurocholataufnahme derKlone D24N, D115N und E257Q und des Wildtyp-Ntcp bestimmt. Beim Wildtyp-Ntcp undden Mutanten D24N und D115N ergab diese eine Sättigungskinetik. Bei Mutante E257Qbestand eine lineare Beziehung zwischen [3H]Taurocholataufnahme und der externen Na+-Konzentration. Der Hill-Koeffizient der [3H]Taurocholataufnahme des Wildtyp-Ntcp beträgt2, er verringerte sich auf 1 für die Mutante D115N und 0,4 für die Mutante E257Q. Hierausläßt sich schließen, dass E257 an der Natriumbindung beteiligt ist. Diese Ergebnisse führten zu einer Hypothese über die Struktur-Funktions-Beziehung in demNtcp-Molekül, nach der sich in der Region des E257 eine Struktur ausbildet, die vergleichbareinem P-loop in Kaliumkanälen, in die Pore des Transporters hineinragt und bei der E257 eineNatriumbindungsstelle darstellt. In mammalians bile acids circulate between the gut, the liver and the bile in the enterohepaticcirculation. The absorption of bile acids from the gut lumen as well as their clearance fromportal blood is mediated by Na+/bile acid cotransporters. In the liver the Na+/bile acidcotransporter is the Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (Ntcp). The aim of this studyis to identify negatively charged amino acids with functional importance for Na+-taurocholatecotransport and to investigate, whether these amino acids are involved in Na+-binding by theprotein. Ntcp mutants were generated by site-directed mutagenesis of the cDNA-clone of the Ntcp.Seven negatively charged amino acids, namely D24, E47, E89, D115, D147, E257 und E277(five conserved and two non conserved), were mutated into their uncharged amides.Functionality was proven by heterologeous expression in X. laevis-oocytes and[3H]taurocholate uptake in the cells. The three mutations D24, D115 and E257 reduced[3H]taurocholate uptake significantly. These clones were tagged by the FLAG®-motiv in orderto follow their expression by immunofluorescence microscopy. The mutants D115N andE257Q were detected in the cell-membrane of the oocytes whereas mutant D24N was notpresent their. This indicates a role of D24 in the appropriate membrane sorting of the Ntcpprotein.The Na+-dependence of the [3H]taurocholate uptake was determined by altering theNa+-concentrations. Wildtype-Ntcp and the mutants D24N and D115N showed saturationkinetics whereas mutant E257Q exhibited a linear relation between [3H]taurocholate uptakeand Na+-concentration. The Hill-coefficient of the [3H]taurocholate uptake of wildtype-Ntcpis 2 and it changed to 1 for the mutant D115N and 0,4 for the mutant E257Q. These resultslead to the conclusion, that E257 is involved in Na+-binding. This study shows, that the amino acids D24, D115, and E257 are of functional relevance forthe Ntcp. D24 is required for the folding across or the insertion into the membrane. D115might generate the cytoplasmatic Na+-binding site of a P-loop structure from which sodiumions are released into the cytoplasma. E257 is with high probability involved in the binding ofextracellular sodium ions.