Kollagenrezeptor alpha2beta1-Integrin auf humanen und tierischen Thrombozyten : Heterogenität und ihre Bedeutung

Abstract

Das Integrin alpha2beta1 stellt als Kollagenrezeptor auf Thrombozyten ein wichtiges Adhäsionsmolekül dar. In dieser Studie konnten wir zeigen, daß die Oberflächendichte dieses Integrins nicht nur von dem Polymorphismus an Position 807 des alpha2 Gens abhängig ist, sondern auch von dem Dimorphismus an Position 1648. Unsere Untersuchungen zeigten eine deutlich gesteigerte Oberflächendichte sowohl in Gegenwart des T807-, als auch des A1648- Allels. Über die genauen Regulationsmechanismen ist bisher nichts bekannt. Darüber hinaus konnten wir eine Abhängigkeit zwischen der Oberflächendichte des Integrins und den verwendeten monoklonalen Antikörpern (mAb) bzw. der Testmethode darstellen. So scheinen die Epitope des mAb Gi9 durch Isolierung der Thrombozyten verändert und somit die Bindungsintensität reduziert zu werden, während dies bei dem mAb Gi14 nicht der Fall ist. Diese Erkenntnisse sind wichtig für die Interpretation von Testergebnissen zur Bestimmung der Oberflächendichte von alpha2beta1. Ein weiterer Aspekt waren Vorarbeiten zur Entwicklung eines Tiermodells, mit dessen Hilfe der Einfluß monoklonaler Antikörper auf die Adhäsion von Thrombozyten an Kollagen dargestellt werden sollte. Untersuchungen zur Reaktivität von Gi9 und Gi14 mit Thrombozyten von Hund, Ratte und Kaninchen zeigten deutlich, daß nur eine Interaktion mit caninen Plättchen möglich war. Die Eignung der Tierart Hund zur Etablierung eines geeigneten Tiermodells konnte eindeutig gezeigt werden. Die Sequenzierung caniner DNA zeigte bei allen Proben den Genotyp C807C. Eine Aussage über den Dimorphismus 1648 beim Hund war nicht möglich.Auch beim Hund zeigte sich eine deutliche Variabilität der Oberflächendichte in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörpers, bzw. der angewandten Methode. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein funktioneller Test zur Überprüfung der Thrombozytenadhäsion in Anlehnung an Bellavite et al. 1994 etabliert und validiert. Der Einsatz der mAb Gi9 und Gi14 in diesem Test mit humanen und caninen Plättchen zeigte deutlich die inhibierende Wirkung von Gi9 auf die Kollagenadhäsion sowohl beim Menschen, als auch beim Hund, unter statischen Bedingungen. Diese Ergebnisse bilden eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Tiermodells, mit dessen Hilfe der klinische Einsatz von Gi9 im Rahmen der antithrombozytären Therapie weiter erforscht werden muß. In this study we showed that the antigen level of alpha2beta1 integrin on the platelet surface not only depends on the polymorphism at position 807 of the alpha2 coding gene but also on the dimorphism at position 1648. Our investigations showed that the increased level on surface alpha2beta1 antigen on platelets correlates with both the presence of a T807- and A1648-allel.Our results also showed a dependence between the detected number of alpha2beta1 molecules on the platelet surface and the used antibodies or the method of testing. The fact that the monoclonal antibody (mAb) Gi9 binds alpha2beta1 much stronger with citrated whole-blood samples as compared to isolated and washed platelets, while mAb Gi14 binds both samples with the same intensity, indicates that the Gi9 epitope is modified during preparation. These findings have important implication for diagnostic and scientific tests analysing surface levels of alpha2beta1. Aditionally, we established and validated a functional test originally described by Bellavite et al. 1994 to detect platelet adhesion to collagen or other ligands under static conditions. Another aspect of this study were investigations for the development of an animal model to test the function of monoclonal antibodies and their influence on the collagen adhesion of platelets. We tested the reactivity of Gi9 and Gi14 with platelets from rat, rabbit and dog. These tests showed a clear interaction of both antibodies with canine platelets but not with platelets from rat or rabbit. Subsequent sequencing of the canine DNA sample revealed only the C807 allele of the alpha2 gene in all cases. Statements about the presence of the dimorphism at position 1648 of the alpha2 gene were not possible. In dogs the variability of alpha2beta1 levels was also dependent on the used antibody. In this study functional tests about the effect of the mAb Gi9 and Gi14 on both human and canine platelets showed that Gi9 is a potent inhibitor of platelet adhesion to collagen under static conditions. Further investigation of this antibody concerning his usage as an antithrombotic drug on patients with thrombotic diseases will be useful. This study provides an important precondition for the development of an animal model to investigate the effect of Gi9 on platelet adhesion in vivo. Our findings suggest the possible use of the species dog to develope such an animal model.