Mechanismus der Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential von kultivierten Neuronen aus dem Plexus myentericus der Ratte

Abstract

Kurzkettige Fettsäuren, die durch die bakterielle Fermentation von Kohlenhydraten produziert werden, sind in hohen Konzentrationen innerhalb des Kolonlumens anwesend. Es ist gezeigt worden, dass sie die Erregbarkeit von enterischen Neuronen ändern. Die vorliegende Untersuchung sollte die Änderungen des Membranpotentials an myenterischen Neuronen durch Butyrat näher charakterisieren und die beteiligten Signalwege klären. Myenterische Neurone von 4 - 10 Tage alten Ratten wurden aus dem Dünndarm durch eine enzymatische Verdauung mit Kollagenase isoliert. Einzelne Zellen und/oder vereinzelte Ganglien wurden aufgesammelt und für 1 Woche in Kultur gehalten. Nach 2 bis 5 Tagen in Kultur wurde das Membranpotential mit der Whole-Cell Patch-Clamp-Technik und die intrazelluläre Ca2+ Konzentration mit der Fura-2 Methode gemessen. Butyrat (10 - 100 mmol l-1) verursachte eine reversible und konzentrationsabhängige Hyperpolarisation der Membran. Diese Hyperpolarisation wurde durch Charybdotoxin (10-7 mol l-1), einen spezifischen Blocker von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen, unterdrückt. Die Butyrat-induzierte Hyperpolarisation war resistent gegen Blockade der Phospholipase C durch U-73122 (10-5 mol·l -1) oder Blockade von IP3-Rezeptoren mittels Heparin (6 ·10 -6 mol l-1). Im Gegensatz hierzu konnte Ruthenium Rot (3·10 -5 mol·l -1), ein Blocker des Ryanodinrezeptors, die durch Butyrat induzierte Hyperpolarisation der Membran sowie die Zunahme der intrazellulären Ca2+ Konzentration erheblich verringern. In Gegenwart von Ryanodin (10-4 mol · l-1) induzierte Butyrat keinen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration mehr, sondern im Gegenteil sank das Fura-2-Signal. Auch in mit Saponin (10 mg·l -1) permeabilisierten Neuronen war Butyrat immer noch in der Lage eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern anzuregen. Somit kann eine direkte Wirkung der kurzkettigen Fettsäure an den Ca2+-Speichern ohne Vermittlung eines löslichen intrazellulären second messengers postuliert werden. Short-chain fatty acids produced by the bacterial fermentation of carbohydrates are present in high concentrations within the colonic lumen and have been shown to alter the excitability of enteric neurons. The present study was designed to investigate the mechanisms of butyrate-induced changes in membrane potential of myenteric neurons. Myenteric neurons from 4 - 10 day old rats were isolated from the small intestine by an enzymatic digestion with collagenase and kept in culture for up to 1 week. After 2 5 days in culture, membrane potential was measured with the whole-cell patch-clamp technique and the intracellular Ca2+ concentration was measured with the fura-2 method. The short-chain fatty acid butyrate (10 100 mmol.l-1) induced a reversible and concentration-dependent hyperpolarization of the membrane with a half-maximal effect at 30 mmol.l-1. The hyperpolarization evoked by butyrate (50 mmol.l-1) was strongly inhibited by charybdotoxin (10-7 mol.l-1), a specific blocker of Ca2+-dependent K+ channels. The butyrate-induced hyperpolarization was resistant against blockade of phospholipase C by U-73122 (10-5 mol.l-1), and resistant against inclusion of heparin (6 . 10-6 mol.l-1), an inositol-1,4,5-trisphosphate receptor antagonist, in the patch-pipette. In contrast, ruthenium red (3 .10-5 mol.l-1), an inhibitor of ryanodine receptors, significantly reduced both the hyperpolarization of the membrane as well as the increase in the intracellular Ca2+ concentration evoked by butyrate. In the presence of ryanodine (10-4 mol.l-1) the increase in intracellular Ca2+ evoked by butyrate was completely suppressed. Even in neurons permeabilized with saponin (10 mg.l-1), butyrate was able to stimulate a release of stored intracellular Ca2+ suggesting a direct action of the shortchain fatty acid at the stores without mediation of a soluble intracellular second messenger.