Vergleichende Darstellung von Dichlorodihydrofluorescein und Dihydrocalcein zur Messung von reaktiven Sauerstoffspezies

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen in der Physiologie und der Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. ROS beeinflussen eine Vielzahl zentraler Prozesse innerhalb der Zelle. Eine Störung der Homöostase und der daraus resultierende Anstieg von ROS wird als oxidativer Stress bezeichnet und führt zu pathophysiologischen Veränderungen. Schwierigkeiten in der Untersuchung von ROS ergeben sich vor allem aufgrund mangelnder Quantität der etablierten Meßmethoden in lebenden Zellen. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Validierung von H2-Calcein als neue Substanz zur Messung von ROS zusammengefasst und dessen Sensitivität und Spezifität in Rattenglattenmuskelzellen (RSMC) mit dem bereits etablierten H2-DCF verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass H2-Calcein grundsätzlich zur Detektion von ROS geeignet ist und dass es im Vergleich zu DCF eine wesentlich längere intrazelluläre Halbwertzeit vorweisen kann. Obwohl beide Substanzen in vitro ähnliche chemische Eigenschaften besitzen, führt eine auf physiologische Weise gesteigerte intrazelluläre ROS-Produktion in RSMC nicht zu einer gesteigerten Calcein-Fluoreszenz, während bei DCF eine signifikanter Zunahme der Fluoreszenz dargestellt werden kann. Letzteres Ergebnis konnte mittels ESR-Messungen bestätigten werden. Im konfokalen Mikroskop konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen in unterschiedlichen Zellkompartimenten akkumulieren. DCF ist größtenteils im Zytoplasma lokalisiert, während Calcein fast ausschließlich auf die Mitochondrien beschränkt ist. Darüber hinaus konnte in submitochondrialen Partikeln (SMP) gezeigt werden, dass H2-Calcein, nicht aber H2-DCF, die Aktivität des Komplex I hemmt. Aus diesen Beobachtungen kann gefolgert werden, dass die Oxidation von H2-Calcein höchstwahrscheinlich die Konsequenz einer direkten Elektronenübertragung zu dem mitochondrialen Komplex I ist. Folglich ist H2-Calcein zur Messung von intrazellulären ROS ungeeignet und bietet keine Alternative zu H2-DCF. Reactive oxygen species (ROS) play an important role in the physiology as well as in the pathophysiology of the cardiovascular system. ROS influence a variety of central processes within the cell. A disturbance of the homeostasis and the subsequent increase in ROS production, also referred to as oxidative stress, results in pathophysiological changes. Difficulties in the analysis of ROS arise due to the low sensitivity of established detection methods within living cells. The present study aimed on the validation of H2-calcein as a new compound for ROS detection and to determine sensitivity and specifity of this new fluorochrome in rat smooth muscle cells (RSMC) as compared to the already established H2-DCF. We could demonstrate that H2-calcein can be used to asses ROS production and that H2-calcein, in comparison to DCF, exhibits a significant longer intracellular half-life. Although in vitro both compounds have similar chemical properties, the stimulation of ROS production under physiological circumstances did not result in an increased calcein fluorescence but DCF did. The latter finding could be confirmed by ESR-measurements. Confocal microscopy revealed that both compounds accumulate in different cellular compartments. DCF mainly localized in the cytoplasm, whereas calcein fluorescence was almost exclusively restricted to the mitochondria. Furthermore, in submitochondrial particles (SMP) H2-Calcein, but not H2-DCF inhibited complex I activity. Taken together, these observations indicate that the oxidation of H2-calcein most likely occurs as a consequence of direct electron transfer to mitochondrial complex I. Therefore, H2-calcein can not be used as a probe for intracellular ROS detection and offers no alternative to H2-DCF.