Charakterisierung ruminanter Pestiviren mittels Polymerasekettenreaktion und monoklonaler Antikörper

Abstract

Innerhalb der Familie Flaviviridae umfasst das Genus Pestivirus das Virus der bovinen Virusdiarrhö (BVDV-1 und 2), das Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) und das Border Disease Virus der Schafe (BDV). Pestiviren infizieren Schweine, Wild- und Haus-wiederkäuer und werden weltweit als Erreger ökonomisch bedeutender Infektionskrankheiten von Nutztieren betrachtet. Die genetische und antigenetische Variabilität innerhalb des Genus Pestivirus lässt die Unterteilung der Pestivirusspezies in Subgruppen zu. In dieser Arbeit wurden 293 Isolate ruminanter Pestiviren, die zwischen 1996 und 2002 isoliert wurden, mittels diskriminierender RT-PCR und real time RT-PCR untersucht. Primer wurden in der 5 nicht-translatierten Region (5 NTR) des Pestivirusgenoms und im Bereich des Npro-Gens etabliert, da für diese Genombereiche bereits zahlreiche Sequenzdaten publiziert wurden. 218 bovine Isolate (78%) aus 127 Beständen (82.5%) aus Deutschland waren BVDV-1 positiv, während 58 bovine Isolate (21%) aus 22 Beständen (14.3%) als BVDV-2 infiziert eingestuft wurden. In 5 Beständen (3.2%) ließen sich BVDV-1 und BVDV-2 nachweisen. 9 bovine Isolate aus England und Frankreich, ein Isolat aus einer Antilope sowie 3 Isolate aus kontaminierten Zelllinien bzw. Seren wurden mittels RT-PCR ebenfalls als BVDV-1 klassifiziert, ein Rinderisolat aus Brasilien als BVDV-2. Ein Isolat (ED) aus einer kontaminierten Zelllinie wurde nur mittels real time RT-PCR als BVDV-2 eingestuft. Von 37 bestimmten Npro-Sequenzen wurden 15 Isolate aus Deutschland den Subgruppen BVDV-1a, b, d und f zugeordnet; 6 bovine Isolate aus Deutschland wurden als BVDV-2a klassifiziert; das Isolat aus Brasilien (s.o.) als BVDV-2b. Zwei Isolate aus Schafen wurden als Vertreter einer möglichen neuen Spezies oder Subgruppe von BDV (BDV-2) charakterisiert, die Isolate Antelope-Pronhorn und Hobi als mögliche neue Spezies innerhalb des Genus Pestivirus.Weiterhin wurden in dieser Arbeit monoklonale Antikörper gegen das E2 Protein von BVDV nach Immunisierung mit rekombinantem E2 der Stämme BVDV-1 CP7 und BVDV-2 890 gewonnen. Die 7 monoklonalen Antikörper erkannten in verschiedenen Testsystemen nur ruminante Pestiviren. Die gewonnenen mAk wurden mittels Immunfluoreszenz, Immunoblot, Neutralisationstest und Immunelektronenmikroskopie charakterisiert. Mit Hilfe der neu gewonnenen Antikörper wurde ein ELISA zum Nachweis von E2 aus Zellextrakten aufgebaut und optimiert. Weitere Versuche zur Etablierung eines Nachweissystems auch aus Untersuchungsmaterial und zur Quantifizierung von E2 z.B. in Impfstoffpräparationen werden durch die neue hergestellte Reagenzien ermöglicht. The genus Pestivirus within the family Flaviviridae comprises bovine viral diarrhea virus (BVDV-1 and 2), classical swine fever virus (CSFV) and border disease virus (BDV) of sheep. Pestiviruses affect swine and wild as well as domestic ruminants and have a significant economical impact on farming worldwide. The genetic and antigenic variability between members of the genus Pestivirus enables subdivision of virus species into subtypes. In this work we examined 293 isolates of ruminant pestiviruses collected between 1996 and 2002 by discriminating RT-PCR and real time RT-PCR. Primers were selected from the 5 nontranslated region (NTR) and N-terminal protease (Npro) coding sequence because of the large number of accessible sequences from these two areas of the genome. 218 (78%) bovine isolates from 127 (82.5%) herds from Germany were BVDV-1 positive whereas BVDV-2 was found in 58 (21%) samples from 22 (14.3%) herds. In 5 (3.2%) herds BVDV-1 as well as BVDV-2 was detected by RT-PCR. 9 bovine isolates from England and France, 1 isolate from an antelope as well as 3 virus isolates from contaminated cell cultures or fetal bovine serum were classified as BVDV-1 and a bovine isolate from Brasil as BVDV-2. One isolate from a contaminated cell line (ED) was shown to represent BVDV-2 only by real time RT-PCR. The nucleotide sequences encoding Npro were determined from 37 virus isolates: 15 bovine isolates from Germany were grouped as BVDV-1a, b, d and f, 6 additional bovine isolates as BVDV-2a. The virus isolate from Brasil (see above) was designated BVDV-2b. Two isolates from sheep were characterized as members of a tentative new spezies or subgroup of BDV (BDV-2), isolates Antelope-Pronhorn and Hobi as tentative new species within the genus Pestivirus. In addition monoclonal antibodies (mAbs) were generated against the E2 protein of BVDV after immunization with recombinant E2 from virus strains BVDV-1 CP7 and BVDV-2 890. In different test systems all 7 mAbs recognized only ruminant pestiviruses. The mAbs were tested by immunofluorescence, immunoblot, neutralization assays and immune electron microscopy. Using the mAbs an ELISA was established for the detection of E2 from cell extracts. Experiments can now be performed to establish an assay for detection of E2 in diagnostic samples and for quantification of E2 e.g. in vaccine preparations.