Histologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Pathogenese des Prolapsus vaginae ante partum beim Schaf

Abstract

Der Prolapsus vaginae ante partum (a.p.) ist ein seit langem bekanntes Krankheitsbild bei Schafen im letzten Drittel der Gravidität. Trotz umfangreicher Forschung konnte bisher keine befriedigende Erklärung der speziespezifisch signifikanten Häufung dieser antepartalen Störung gegeben werden. Ziel dieser Studie war es deshalb, neben der Überprüfung der Elektrolythomöostase und der endokrinologischen Situation weitere Erklärungsansätze der Pathogenese des ovinen Vaginalprolaps a.p. zu erhalten. Mittels einer Expressionsstudie wurde der Bindegewebsstoffwechsel erkrankter Schafe mit dem gesunder, hochgravider Tiere und den Verhältnissen intra partum (i.p.) verglichen. Die Überprüfung der Hypothese einer lokal erhöhten Östrogenwirkung bei erkrankten Probanden erfolgte anhand der mRNA-Expression des Östrogenrezeptors alpha. Zusätzlich wurde die Struktur der Vaginalwand von hochgraviden Schafen mit und ohne Vaginalprolaps und Tieren i.p. histologisch analysiert. Hierzu wurden von 5 hochgraviden, gesunden Probanden, 4 Schafen i.p. und 6 Tieren mit einem Prolapsus vaginae a.p. Blutproben und Biopsien der Vaginalwand entnommen. Aus dem Blutplasma erfolgte die Bestimmung der Elektrolyte Kalzium, anorganisches Phosphat, Magnesium und Natrium sowie der Konzentration der Steroidhormone Progesteron und Östradiol-17 beta. Die molekularbiologischen Untersuchungen wurden mit Hilfe einer RT-PCR durchgeführt und beinhalteten die Analyse der Genexpression der alpha 2-Kette des Kollagen I, der kollagenolytischen MMP 1, deren Inhibitor TIMP 1 und des Östrogenrezeptors alpha. Bei den Tieren mit Vaginalprolaps a.p. lag eine subklinische Hypokalzämie vor. Die Differenzen zwischen den drei Gruppen erwiesen sich jedoch als statistisch nicht signifikant. Auch die Elektrolyte Phosphat, Magnesium und Natrium zeigten keine statistisch abzusichernden Gruppenunterschiede. Die mittlere Konzentration des Progesterons erkrankter Probanden lag höher als bei den Kontrolltieren a.p. und i.p.; allerdings ergab sich keine statistische Signifikanz dieser Unterschiede. Für Östradiol-17 beta konnte eine statistisch nicht abzusichernde Erhöhung der peripheren Plasmawerte bei Tieren mit einem Prolapsus vaginae a.p. gegenüber der graviden Referenzgruppe ermittelt werden. Die Expressionsstudien ergaben einen Hinweis auf einen antepartal veränderten Kollagenmetabolismus bei Schafen mit einem Vaginalprolaps. Die Expressionsrate der alpha 2-Kette des Kollagen I war in prolabiertem Gewebe statistisch signifikant niedriger als bei der hochgraviden Kontrollgruppe (p < 0,01). Tendenziell unterschied sich der mittlere mRNA-Gehalt der MMP 1 und des TIMP 1 betroffener Probanden von dem gesunder, hochgravider Tiere durch ein höheres beziehungsweise niedrigeres Niveau. Eine statistische Absicherung der Ergebnisse gelang nicht. Der Östrogenrezeptor alpha wurde von Schafen mit einem Prolapsus vaginae statistisch signifikant geringer exprimiert als von gesunden Tieren a.p. (p < 0,01). Zwischen den Verhältnissen i.p. und bei Vorliegen eines antepartalen Vaginalprolaps konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede ermittelt werden. Die lichtmikroskopisch nachvollziehbaren Differenzen bezogen sich vor allem auf die Höhe und Gestalt des vaginalen Epithels. Subepitheliale Abschnitte der Vaginalwand zeigten nur i.p. eine geringe Ödematisierung, die den anderen Gruppen fehlte. Das Epithelium vaginae stellte sich bei Schafen mit einem antepartalen Vaginalprolaps am höchsten heraus (p < 0,0001). Begründet wurde dieser Unterschied durch eine Hyperplasie des Vaginalepithels, die bei erkrankten Individuen durch eine statistisch signifikante Zunahme der Zellagen gekennzeichnet war (p < 0,0001). Die eigenen Ergebnisse bezüglich der Elektrolythomöostase und dem Steroidhormonhaushalt bestätigen die in der Literatur bekannten Verhältnisse bei Schafen mit einem Prolapsus vaginae a.p.. Aufgrund der neuen Erkenntnisse der Expressionsstudien kann davon ausgegangen werden, daß in der Ätiologie der Erkrankung eine Störung im vaginalen Bindegewebsstoffwechsel vorliegt. Eine lokale hyperöstrogene Wirkung innerhalb des Vaginalgewebes durch eine generelle Überexpression des Rezeptors muß aufgrund der Resultate als ätiologischer Faktor abgelehnt werden. Auch histologisch fanden sich keine Anzeichen einer Östrogenisierung des vaginalen Gewebes erkrankter Schafe. Vaginal prolapse ante partum (a.p.) is a well known disease during the last third of gestation in sheep. In spite of various clinical and endocrinological investigation the exact cause of the significant accumulated occurrence of this prepartum disorder in ewes has not been ascertained. The aim of this study was to proove the plasma electrolyte concentrations and hormone profiles and, in addition, to obtain further aspects of the pathogenesis of the ovine vaginal prolapse in late gestation. By means of an expression study the connective tissue metabolism of the vaginal wall in affected and unaffected pregnant sheep and ewes during parturition was examined. The hypothesis of an increased estrogenic effect was tested by the estimation of the mRNA-level of the estrogen receptor alpha. Additionally, the morphology of the vaginal wall of ewes with and without vaginal prolapse and animals intra partum (i.p.) was examined. Blood samples and biopsies of the vaginal tissue were taken from 5 heavily pregnant, unaffected animals, 4 sheep during parturition and 6 ewes suffering from vaginal prolapse ante partum. The blood samples were submitted for calcium, inorganic phosphorus, magnesium and sodium estimation and for determining the concentration of the steroid hormones progesterone and estradiol-17 beta. Investigations in the mRNA-expression including the estimation of the transkript levels of the alpha 2-chain of collagen I, the collagenolytic MMP 1, its inhibitor TIMP 1 and the estrogen receptor alpha were carried out by using RT-PCR. Animals suffering from vaginal prolapse a.p. showed subclinical hypocalcaemia. The differences between the 3 groups did not proove statistical significance. Also the electrolytes inorganic phosphorus, magnesium and sodium did not show group differences of the arithmetic mean wich can be secured statistically. The average progesterone concentration of affected ewes was above those of control animals a.p. and i.p.; however no significant differences were noticed. In reaction to pregnant control group the plasma levels of estradiol-17 beta in animals suffering from antepartum vaginal prolapse were increased, but without statistical insurance. The anaylsis of the mRNA expression pointed out a distinct change in the antepartum collagen metabolism in sheep suffering from vaginal prolapse. In prolapsed tissue the alpha 2-chain of collagen I showed a decreased expression level in relation to heavily pregnant control animals (p < 0,01). The average mRNA-synthesis of MMP 1 and TIMP 1 in affected ewes varied from those in healthy, heavily pregnant sheep by a higher and/or lower level. Significant differences could not be noticed. The production of transcripts of the estrogen receptor alpha by sheep suffering from vaginal prolapse was decreased significantly in comparison to unaffected pregnant ewes (p < 0,01). There was no statistical insurance in the differences between intrapartum sheep and ewes with prolapsed vaginal wall. In the light microscopic study, differences were noted in height and morphology of the vaginal epithelium. Edema was pronounced only in the subepithelial zone of the vaginal wall of intrapartum sheep and was not found in other groups. The highest vaginal epithelium was identified in sheep suffering from antepartum vaginal prolapse. The increase in epithelial height was due to hyperplasia of the epithelial cells, which was characterized by a statistically significant increased number of cell layers with ewes suffering from vaginal prolapse (p < 0,0001). The own results concerning the electrolytes and steroid hormons in sheep suffering from vaginal prolapse ante partum agreed with further observations by other investigators. The new results argue in favour of a disorder in the collagen metabolism of vaginal connective tissue as an aspect in pathogenesis of this disease. An increased estrogenic effect onto the vaginal tissue due to an over expression of its receptor must be rejected. There were also no histological signs of an increased estrogenic effect within the vaginal tissue of affected sheep.