Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen am Hengstejakulat sowie biochemische Analysen des Seminalplasmas

Abstract

Die Diagnostik männlicher Fertilitätsstörungen führt häufig zu unbefriedigenden Ergebnissen, da mit den klassischen, vor allem auf der Lichtmikroskopie beruhenden Untersuchungsverfahren ein erheblicher Teil der möglichen Ursachen, insbesondere Störungen der Spermatozoenfunktion, nicht erfasst werden können. Dies trifft auch für den Hengst zu, bei dem schlechte Befruchtungsergebnisse im Vergleich zu anderen Haussäugetierarten relativ häufig vorkommen. Das Beurteilungsspektrum für equine Ejakulate sollte deshalb in der vorliegenden Arbeit durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und biochemische Analysen des Seminalplasmas erweitert werden. Die TEM eignet sich aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens besonders zur detaillierten Darstellung spermien-spezifischer Feinstrukturen, wie Akrosom und Geißel. Ebenso könnten auch biochemische Analysen des Seminalplasmas bezüglich Enzymaktivitäten und Zusammensetzung an Makro- sowie Mikroelementen beim Hengst Hinweise auf das Vorliegen sowie auf mögliche Ursachen einer Pathospermie geben. Ziel der eigenen Arbeit war es daher, zunächst an fertilen Hengsten Referenzwerte für die untersuchten Parameter zu etablieren und dann die getesteten Methoden auf ihre Eignung in der Fertilitätsdiagnostik beim Hengst zu untersuchen. Insgesamt standen Ejakulate von 73 Hengsten für die Untersuchungen zur Verfügung, wobei von 46 dieser Probanden die Fertilität bekannt war. Basierend auf den Befruchtungsergebnissen der vorangegangenen Zuchtsaison wurde eine Klassifizierung der Probanden nach fertil (Konzeptionsraten 70-100 %), subfertil (Konzeptionsraten 10-70 %) und infertil (Konzeptionsraten < 10 %) vorgenommen. Diese Daten wurden dem Untersucher erst nach der Auswertung der Ergebnisse bekannt gegeben. Des Weiteren erfolgte zum Vergleich klassischer Parameter mit Seminalplasmawerten eine Einteilung der Ejakulatproben in die Kategorien normal , geringgradig abweichend und hochgradig abweichend . Geringgradig abweichende Ejakulate wiesen bezüglich eines Parameters leichte und hochgradig abweichende Ejakulate bei mindestens einem der untersuchten Parameter deutliche Deviationen von der Norm auf. Nach Desemination der Hengste wurde unmittelbar im Anschluss eine konventionelle makroskopische, chemisch-physikalische und lichtmikroskopische Ejakulat-untersuchung durchgeführt sowie Seminalplasma durch Zentrifugation des Samens gewonnen. Außerdem wurde ein Spermaaliquot mit 2 % Glutaraldehyd und 0,1 % Pikrinsäure fixiert und für die TEM aufgearbeitet. Zur TEM-Evaluierung wurde jeweils eine im Frühjahr entnommene Samenprobe der 46 Tiere mit bekannten Konzeptionsraten herangezogen. Hierbei erfolgte die Beurteilung von je 200 Akrosomen, Spermienköpfen, Mittelstücken und Geißelquerschnitten sowie 100 Geißellängsschnitten jedes Ejakulates. Für die biochemischen Analysen wurden zu 3 verschiedenen Terminen (Frühling, Sommer, Spätherbst/Winter) Proben gewonnen. Dabei fanden 27 Hengste ausschließlich einmal, 35 Hengste zu zwei Terminen sowie 11 Hengste zu drei Terminen Eingang in die Studie. Bezüglich der biochemischen Analysen wurden die Aktivitäten der Enzyme AST, GLDH, GGT, AP, SP, CK und LDH sowie die Gehalte der Mengenelemente Natrium, Kalium, Kalzium (gesamt und ionisiert), Magnesium, Phosphat und Chlor sowie der Spurenelemente Kupfer, Eisen und Zink ermittelt. Bei den transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem erhöhten prozentualen Anteil akrosomaler Deformationen (abgehobene Akrosomen) sowie einer reduzierten Fertilität (p = 0,034; r = - 0,31). Bei fertilen Hengsten war ein geringerer prozentualer Anteil [& #61560;g (SF)] von 4,9 (3,2) % nachweisbar als bei sub- [7,9 (1,9) %] respektive insbesondere infertilen Probanden [11,4 (4,2) %]. Obwohl die Eignung zur Klassifizierung von Hengsten mit unbekannter Fruchtbarkeit hier nicht überprüft wurde, legen die eigenen Ergebnisse den Schluss nahe, dass die TEM-Beurteilung des Akrosoms zur Einstufung der Hengste bezüglich ihrer Fertilität geeignet ist und wichtige Hinweise auf vorliegende Fertilitätseinschränkungen geben kann. Hilfreich ist die TEM ebenfalls zur Abklärung von Infertilitätsfällen unklarer Ätiologie. Neben Spermien konnten in den Ejakulaten Spermatiden und Makrophagen detektiert sowie erstmals beim Hengst mittels TEM verifiziert werden. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten dieser Zellen und der Fruchtbarkeit war nicht nachweisbar. Weiterhin gelang im Hengstejakulat eine Erstbeschreibung der sogenannten bizarre forms , einer Ansammlung von Kopf- und Geißelquer- sowie längsschnitten mit einer gemeinsamen umhüllenden Membran, die im Mittel mit 15,0 (2,1) % in den Proben nachweisbar waren. Diese wurden bisher erst bei Rotwölfen erwähnt und werden als eine Entwicklungsanomalie der Spermatozoen diskutiert. Auch die Analysen des Seminalplasmas ermöglichen eine differenzierte Aussage über die Ejakulatqualität. In diesem Zusammenhang sind von den untersuchten Enzymen insbesondere die Laktat-Dehydrogenase (LDH) sowie die Alkalische Phosphatase (AP) und Saure Phosphatase (SP) zu nennen. Hier ließen sich Korrelationen der LDH zur Gesamt- (p = 0,0062, r = 0,3217) und Progressivmotilität (p = 0,0048, r = 0,33), zur Dichte (p = 0,025; r = 0,2694) und zum Volumen (p = 0,009; r = - 0,3079) ermitteln. Für die testikulär und epididymal lokalisierten Enzyme AP und SP konnte ein signifikanter positiver Zusammenhang zur Dichte (p (SP, AP) < 0,0001;r (SP) = 0,4808, r (AP) = 0,6154) verifiziert werden. Dies stützt die Hypothese, dass beide Enzyme eine Eignung besitzen, Auskunft über den vollständigen beziehungsweise unvollständigen Ablauf der Reflexkette zu geben. Die ebenfalls nachgewiesene, negative Beziehung der AP respektive SP zum Volumen (p (SP) = 0,0004, r (SP) = - 0,412; p (AP) < 0,0001, r (AP) = - 0,5696) belegt den bereits postulierten testikulären und epididymalen Ursprung. Bezüglich der Mikroelemente gelang der Nachweis einer signifikanten Beziehung zwischen Fertilität sowie der Zinkkonzentration im Sommer (p = 0,017) und im Spätherbst/Winter (p = 0,048), nicht jedoch im Frühjahr. Weiterhin existierten signifikante Unterschiede der Kupferkonzentration im Seminalplasma zwischen normalen und hochgradig abweichenden Ejakulaten sowie der Eisenkonzentration zwischen normalen und geringgradig abweichenden Ejakulaten, was auf weiterführende diagnostische Einsatzmöglichkeiten hindeutet. Zwischen elektronenmikroskopisch festgestellten spontanen Akrosomenreaktionen und erhöhten Gehalten an ionisiertem Kalzium im Seminalplasma konnte ein Zusammenhang ermittelt werden. Eine Eignung der Kalziumbestimmung für den diagnostischen Einsatz in speziellen Fällen wird anhand eines Hengstes mit deutlich oberhalb des Medians liegender Konzentrationen ionisierten Kalziums im Seminalplasma postuliert, welcher anamnestisch durch reduzierte Haltbarkeit des Ejakulates im Versand und durch einen im Vergleich zu den anderen Probanden relativ hohen Anteil an elektronenmikroskopisch detektierbaren Akrosomenreaktionen auffiel. Insgesamt stellte sich die TEM im Rahmen dieser Untersuchungen als geeignete Methode zur Fertilitätsdiagnostik heraus, die in speziellen Fällen ergänzend und auch zur ätiologischen Abklärung Anwendung finden sollte. Insbesondere aufgrund des Nachweises einer deutlichen Korrelation zwischen Fertilität und prozentualem Anteil abgehobener Akrosomen stellt die TEM eine wertvolle Erweiterung des derzeitigen Methodenspektrums zur Beurteilung equiner Ejakulate in Bezug auf die Befruchtungsfähigkeit dar. Auch die Analysen des Seminalplasmas sind somit im Rahmen der erweiterten Ejakulatdiagnostik empfehlenswert. Hierbei muss allerdings betont werden, dass hinsichtlich der Fertilität ausschließlich das Spurenelement Zink besondere Beachtung verdient, da sich trotz zahlreicher Korrelationen zu konventionellen Ejakulatparametern für die übrigen gemessenen Seminalplasmabestandteile keine signifikanten Korrelationen zu den anamnestisch erhobenen Fruchtbarkeitsdaten ergaben. Diagnostic of male infertility often leads to unsatisfactory results, because a substantial proportion of possible reasons, especially dysfunctions of spermatozoa, can not be detected with classical examination techniques which are mainly based on light microscopy. This also applies to stallions in which poor fertilisation occurs quite often in comparison with other mammalian species. Thus, in this study the use of transmission electron microscopy (TEM) and biochemical analysis of seminal plasma was investigated as diagnostic tools in addition to classical routine methods. TEM may be especially suited because of its capacity to picture at high resolution sperm specific fine structures, like acrosome and tail. Likewise, biochemical analysis of enzyme activities and concentrations of macro- and microelements in seminal plasma could provide information on the occurrence of pathospermia and their causes. Thus, the aim of this work was to establish reference values in normally fertile probands for the parameters examined and then to test the methods for their suitability in fertility diagnostic in stallion. In total, ejaculates of 73 stallions were available for examination. In 43 of these animals, fertility was known. Based on the conception rates of the last breeding season, the animals were classified as fertile (conception rates 70-100 %), subfertile (conception rates 10-70 %) and infertile (conception rates < 10 %). However, these data were provided to the examiner only after completion of evaluation. Furthermore, the ejaculates were classified into the categories normal , minor deviations , major deviations for comparison of classical parameters with seminal plasma dates. Samples with minor deviations showed small, probes with major deviations considerable aberrances of at least one parameter in classical sperm analysis. Immediatly after desemination of the stallions, a conventional macroscopic, chemical-physical and lightmicroscopic semen analysis was performed and seminal plasma was obtained by centrifugation of semen. Additionally, a semen aliquot was fixed with 2 % glutaraldehyde and 0.1 % picric acid and processed for TEM. Samples for TEM sperm analysis were collected in spring from the stallions with known fertility and 200 acrosomes, sperm heads, midpieces and cross sections of tails and 100 longitudinal sections of tails were evaluated. For biochemical analysis, seminal plasma samples were collected in spring, summer and late autumn/winter. 27 stallions were examined only once, 35 animals twice and 11 three times. In seminal plasma samples, activities of Aspartate-Amino-Transferase (AST), Glutamate Dehydrogenase (GLDH), Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT), Alkaline Phosphatase (AP), Acid Phosphatase (SP), Creatinine Kinase (CK) and Lactate Dehydrogenase (LDH) were measured as well as the concentrations of the macroelements sodium, potassium, calcium (total, ionised), magnesium, phosphate and chloride and of the microelements copper, iron and zinc. With TEM, a significant correlation was found between an increased percetage of acrosomal deformities (detached acrosomes) and reduced fertility (p = 0.034; r = - 0.31). In fertile stallions, with 4.9 (3.2) % a lower frequency [g (SF)] was found than in subfertile [7.9 (1.9)] and infertile stallions [11.4 (4.2)]. Although the suitability of TEM for identification of stallions with impaired fertility was not examined here, the results of this study suggest that TEM evaluation of acrosomes is a valuable diagnostic tool in the assessment of fertility in stallions. Using TEM, for the first time spermatids and macrophages could be identified in equine ejaculates. A correlation between the occurence of these cells and fertility could not be proven. Furthermore, this study provided a first description of the so called bizarre forms , an accumulation of head and tail cross and longitudinal section within one common membrane, in stallion semen succeeded. They were found in 15.0 (2.1) % in ejaculate samples. These structures were hitherto only mentioned in red wolf and were discussed as a primary anomaly of spermatozoa in this species. Analysis of seminal plasma also allows differenciated estimation about the quality of the ejaculate. In this regard, among the enzymes examined especially LDH, AP and SP have to be mentioned. Significant correlations between LDH and motility (p = 0.0062, r = 0.3217), progressive motility (p = 0.0048, r = 0.33), sperm count (p = 0.025; r = 0.2694) and volume (p = 0.009; r = - 0.3079) were found. For AP and SP which in the male genital tract are mainly expressed in the testis and epididymidis, a significant positive correlation to sperm count (p (SP, AP) < 0.0001; r (SP) = 0.4808, r (AP) = 0.6154) could be verified. This supports the hypothesis that both enzyme activities are useful parameters to assess the degree of semen mobilisation from testicular and epididymal reservoirs during the desemination reflexes. Consistent with the testicular and epididymal expression of AP and SP, a negative correlation of AP resp. SP to volume (p (SP) = 0.0004, r (SP) = - 0.412; p (AP) < 0.0001, r (AP) = - 0.5696) was found. Concerning the microelement concentrations in seminal plasma, a significant correlation between fertility and zinc concentrations was found in summer (p = 0.017) and late autumn/winter (p = 0.048) but not in spring. Furthermore, significant differences of copper concentrations existed between normal semen samples and those with major deviations as well as of iron concentrations between normal ejaculates and those with minor deviations which suggest that these parameters may be suitable as diagnostic tools. A significant correlation between spontaneous acrosomal reactions detected with TEM and increased concentrations of ionised calcium in seminal plasma could also be shown. The use of calcium measurement in certain cases is illustrated by a stallion in which semen quality was profoundly reduced after storage or shipping. High concentrations of ionised calcium in seminal plasma and a high rate of acrosomal reactions have been confirmed in this animal. In conclusion, results of this study indicate that TEM is a useful diagnostic in stallions that should be applied in addition to conventional semen analysis. Analysis of seminal plasma is also advisable for advanced ejaculate diagnostic. However, it has to be emphasised that despite many correlations between seminal plasma parameters and parameters of conventional ejaculate analysis only zinc concentrations exhibited a significant correlation to fertility data.