Konservierte Gene für Oberflächenproteine der Mikrofilarienscheide bei den unbescheidete Mikrofilarien freisetzenden Arten Acanthocheilonema viteae und Onchocerca volvulus

Abstract

Innerhalb der taxonomischen Superfamilie der Filarien (Filarioidea) besteht für die ersten Larven, die Mikrofilarien, eine Dichotomie: Bei den Erregern der lymphatischen Filariose des Menschen, Wuchereria bancrofti und Brugia spp., sowie einigen tierspezifischen Gattungen, z.B. Litomosoides, sind die Mikrofilarien von der modifizierten Eihülle, einer sog. Scheide umgeben, während bei anderen Filarien, so der veterinärmedizinisch wichtigen Art Dirofilaria immitis beim Hund, der experimentell-parasitologisch häufig eingesetzten Nagerfilarie Acanthocheilonema viteae und Onchocerca volvulus, dem Erreger der menschlichen Flussblindheit die Mikrofilarien im Uterus die Eihülle verlassen und unbescheidet freigesetzt werden. Im ersten Fall ist die Scheide eine die Larve lose umgebende Hülle wegen ihrer geringen Durchlässigkeit die eigentliche Interaktionsfläche mit dem Immunsystem des Wirtes, im anderen Fall ist es die Kutikula der Mikrofilarie. In den vergangenen Jahren wurden sechs Hauptproteine der Mikrofilarienscheide von L. sigmodontis, Shp1, Shp1a, Shp2, Shp3, Shp3a und Shp4 sowie ausser Shp4 ihre Orthologe bei Brugia spp. auf molekularer Ebene charakterisiert und in ihrer Genese im Zuge der embryonalen Entwicklung dargestellt. Die hoch konservierten, Muzin-ähnlichen Proteine Shp3a und Shp3 wurden als Hauptbestandteile der Mikrofilarienscheiden-Oberfläche identifiziert. Sie sind ein Produkt des Uterusepithels des weiblichen Wurms und spielen offensichtlich eine wichtige Rolle in der Evasionsstrategie des Parasiten, da parasitämische Wirte keine Antikörper gegen sie bilden. Im Zusammenhang mit der Dichotomie bei der Scheidenbildung erhob sich die Frage, inwieweit Shp3a und Shp3 auch bei A. viteae und O. volvulus konserviert sind, die scheidenlose Mikrofilarien freisetzen. Das A. viteae-Genom enthält eine homologe shp3a-shp3-Region. Sie zeigt wie bei L. sigmodontis und B. malayi eine konservierte Syntänie und enge Genkopplung, aber anders als bei L. sigmodontis und B. malayi, bei denen die Gene in einem Tandem organisiert sind, weisen die beiden paralogen A. viteae-Gene shp3a und shp3 eine divergente Orientierung auf. Analysen der genomischen Sequenz von A. viteae deuten auf eine Inversion des Av-shp3a-Gens hin; zudem ist die Kodierregion von Av-shp3 deletiert. Av-Shp3a ist ein sekretorisches, Muzin-ähnliches Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 12.04 kDa, dessen Aminosäuresequenz, wie bei Shp3a und Shp3 von Brugia spp. und L. sigmodontis in drei Abschnitte unterteilt werden kann: eine sekretorische Standard-Signalsequenz, eine Serin/Threonin-reiche Region mit fünf potentiellen N-Glykosilierungsstellen und eine hydrophobe C-terminale Region, die ein besonders auffälliges, bei allen untersuchten Spezies konserviertes Tryptophan-reiches Motiv (WWCWW) beinhaltet. 3 -stromabwärts des shp3a-Gens von A. viteae wurde ein weiteres Gen mit Homologie zu einem Caenorhabditis elegans-Gen, das für ein hypothetisches Protein C29F5.1 kodiert, mit mehreren homologen O. volvulus-EST-Sequenzen in der Datenbank identifiziert. Die Amplifikation der genomischen O. volvulus-Sequenz mit Oligonukleotiden aus den hoch konservierten, flankierenden Genen OvC29F5.1 und Ov-Intergen (dieses Gen besitzt in A. viteae geschlechtsspezifische Splicevarianten und eine konservierte Nukleosid-Transporter-Domäne) und eine anschliessende Klonierung und Sequenzierung resultierten zwar in der Isolierung der flankierenden Gene, aber die dazwischen liegende Sequenz enthielt abweichend von L. sigmodontis, B. malayi und A. viteae kein orthologes shp3a-Gen. Die Promotorsequenz ist bei allen shp3a- und shp3-Genen hoch konserviert. Über eine Länge von 198 bp besteht unter den 6 Promotor-Sequenzen von L. sigmodontis, B. malayi und A. viteae eine aussergewöhnlich hohe Identität von 75%. Eine Av-shp3-Promotorsonde hybridisierte unter den gewählten wenig stringenten Bedingungen im Southern Blot jedoch nicht mit Fragmenten von O. volvulus. Dieses Ergebnis lässt die Annahme zu, dass die Gene shp3a und shp3 bei O. volvulus nicht konserviert sind. Die Transkription von Av-shp3a erfolgt sowohl im Uterusgewebe als auch in den intrauterinen Ring- und Brezelstadien. In den Weibchen besteht ein Transkriptionsgradient mit abundanter Transkription in dem Wurmsegment, in dem im Uterus Ring- und Brezelstadien enthalten sind. Hiermit stellt sich ein Unterschied zu L. sigmodontis dar, bei dem die Transkription und Expression des shp3a-Gens ausschliesslich im Uterusepithel des apikalen Wurmabschnittes, der gestreckte Mikrofilarien enthält, stattfindet. Das A. viteae-Protein konnte mittels eines polyklonalen Antiserums gegen ein rekombinantes Peptid aus dem Av-Shp3a-C-Terminus im Immunoblot in A. viteae-Weibchen, Gesamt-Embryonalstadien sowie im Wurmabschnitt, der sich 2.5 cm vom apikalen bis zum kaudalen Ende erstreckt und auch Ring- und Brezelstadien enthält, erst nach Zusatz von CHAPS zum Transferpuffer nachgewiesen werden. Blutmikrofilarien und Männchen enthielten kein nachweisbares Av-Shp3a. Das Protein konnte jedoch weder in Gefrierschnitten noch in fixierten Präparaten immunhistologisch erfasst werden. Aus der berechneten molekularen Masse der Peptidkette von 12.04 kDa und dem gelelektrophoretisch bestimmten Molekulargewicht von 22 kDa lässt sich auf erhebliche posttranslationale Modifikationen schliessen. Av-Shp3a trägt kein Phosphat-gebundenes Dimethylaminoethanol, das bei den orthologen L. sigmodontis- und B. malayi-Proteinen die Hauptmasse der Modifikationen darstellt, könnte aber nach Untersuchungen mit einem Phosphorylcholin (PC)-spezifischen Antikörper PC enthalten. Die Bildung von Antikörpern gegen Av-Shp3a in A. viteae-infizierten Nagern ist wahrscheinlich, konnte jedoch nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. Die Ergebnisse lassen nicht annehmen, dass Av-Shp3a eine Rolle in der Evasionsstrategie der Mikrofilarien spielt, wie dies für die homologen Proteine aus L. sigmodontis und B. malayi gilt. Die biologische Funktion von Av-Shp3a ist möglicherweise in der Abundanz des Proteins in Embryonalstadien zu suchen: Av-Shp3a könnte als Muzin-ähnliches Protein eine Art Gleitmittel, sog. "Lubrikant", im Uterus bilden. Microfilariae of several filarial genera of the superfamily Filarioidea, e.g. the causative agents of human lymphatic filariasis Wuchereria bancrofti and Brugia spp. as well as animal-specific genera like Litomosoides are completely enclosed by an antibody impermeable modified eggshell, the so-called microfilarial sheath. In other genera, e.g. the rodent filaria Acanthocheilonema viteae, which is frequently used as model parasite, Onchocerca volvulus, the causative agent of river blindness in man and Dirofilaria immitis, an important pathogenic filaria in dogs the larvae hatch from the eggshell during their intrauterine development and are released sheathless. Thus, the host-parasite interface in the first cases is the sheath surface, whereas in the latter cases it is represented by the larval cuticle. Six major microfilarial sheath proteins of L. sigmodontis (Shp1a, Shp1, Shp2, Shp3a, Shp3, and Shp4) and, except Shp4, their orthologues from B. malayi have been recently characterized at the molecular level, and with emphasis on their expression sites within the female parasite. Shp3a and Shp3 were identified as mucin-like sheath surface proteins which are highly conserved. These surface antigens are a product of the uterus epithelium and with high probability are involved in the immune evasion of the larvae since they are not recognized in microfilaraemic hosts. The present studies should evaluate whether Shp3a and Shp3 are also conserved in filariae which release unsheathed microfilariae as A. viteae and O. volvulus. The genome of A. viteae contains a homologous shp3a-shp3 genomic region. It reveals a conserved synteny but the orientation of the paralogous genes shp3a and shp3 is divergent, whereas in both genera, Brugia and Litomosoides, the shp3a and shp3 genes are arranged in tandem. Analyses of the genomic A. viteae sequence indicate the inversion of the shp3a gene and the deletion the coding region of shp3. Av-shp3a encodes a secreted, mucin-like protein with a calculated molecular weight of 12.04 kDa. The deduced polypeptid chain shows a domain structure similar to that of Shp3a and Shp3 of Brugia spp. and L. sigmodontis: a signal peptid sequence, a Ser/Thr-rich domain with 5 potential N-glycosylation sites, and a hydrophobic C-terminal domain with a conserved tryptophan-rich motif WWCWW. Next to the shp3a gene of A. viteae a gene was identified with significant homology to a Caenorhabditis elegans gene coding for a hypothetical protein (C29F5.1) as well as to several homologous O. volvulus ESTs in data banks. Amplification of the O. volvulus genomic sequence using primers corresponding to the highly conserved flanking genes, C29F5.1-homologue and intervening gene (in A. viteae with sex-specific splice variants and conserved nucleoside transporter domain) with subsequent cloning and sequencing resulted in the isolation of the flanking genes but in contrast to L. sigmodontis, B. malayi and A. viteae no shp3a homologue could be detected between them. The core promotor sequence of all shp3a and shp3 genes is highly conserved. It encompasses 198 bp with an unusually high similarity of 75 % identical residues between the six promoter sequences of L. sigmodontis, B. malayi and A. viteae. Genomic Southern blot analysis using a DNA probe from the shp3 core promoter sequence of A. viteae revealed with the selected low stringency conditions no homologous sequences in O. volvulus. These results suggest that the genes shp3a and shp3 are not conserved in O. volvulus. Av-shp3a is transcribed in the uterus wall as well as in the intrauterine developmental ring and bretzel stages. In female worms, there is a transcription gradient with abundant transcription in the worm segment with the uterus containing ring and bretzel stages. This is a significant difference to L. sigmodontis where transcription and expression of shp3a is limited to the terminal uterus part containing stretched microfilariae. The protein Av-Shp3a could be demonstrated by immunobloting using a polyclonal antiserum against one recombinant peptide derived from the C-terminal region of the molecule only after adding CHAPS to the transfer buffer. The protein migrates to a 22 kDa position and occurs in females, intrauterine embryonal stages and in the female worm part containing ring and bretzel stages. Av-Shp3a could not be detected in blood microfilariae and male worms. However, we failed to identify the protein by immunohistological methods in cryosections and paraffine sections. A considerable proportion of the Av-Shp3a molecular mass is due to post-translational modifications, as estimated from the calculated and SDS-PAGE determined molecular mass. Av-Shp3a does not contain detectable phosphate-bound Dimethylaminoethanole, which constitutes the main part of the modifications of the orthologous L. sigmodontis- and B. malayi-proteins. However, it possibly bears phosphorylcholin (PC) modifications. In conclusion, Av-Shp3a, a mucin-like protein, does not seem to play a role in the evasion strategy of the microfilariae as it is suggested for the homologous proteins of L. sigmodontis and B. malayi. Its biological function rather could be to act as a lumbricant allowing the intrauterine passage of the embryonic stages.