Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Verfahren zum Nachweis von Kuhmilch in Ziegenmilch und -käse

Abstract

Zum Nachweis einer Verfälschung von Ziegenmilcherzeugnissen mit Kuhmilch wurde eine PCR-Methode auf Basis speziesspezifischer Oligonukleotidprimer für das bovine Cytochrom b-Gen entwickelt, mit der es möglich ist -unabhängig von der Verarbeitungsart der Käse- einen Kuhmilchzusatz zu Ziegenkäse und anderen Erzeugnissen aus Ziegenmilch sicher zu erkennen. Für die DNA-Extraktion wurde das Verfahren nach ROMERO und LOPEZ-GONI (1999) unter Verwendung eines NET-Puffers angewendet. Ein Probenvolumen von 600 myl erwies sich unter praktischen Gesichtspunkten als optimal. In umfangreichen Vorversuchen wurden molekularbiologische Verfahren auf der Basis von universellen Primer für das cytb-Gen in Verbindung mit dem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus getestet. Diese erwiesen sich jedoch als ungeeignet, da in Mischungen aus Kuh- und Ziegenmilch häufig falsch-negative Ergebnisse erzielt wurden. Mehrere Systeme zum direkten Nachweis bovinen cytb-Gens unter Verwendung speziesspezifischer Primer wurden geprüft. Hier konnte ein Testsystem etabliert werden, mit dem Kuhmilchzusätze zu Ziegenmilch bzw. Ziegenkäse zuverlässig detektiert werden konnten, mit einer Nachweisgrenze von 1 % Kuhmilchanteil. Eine Anwendungsstudie dieser PCR Methode bei 165 Handelsproben zeigte, dass ein erheblicher Anteil (13 %) der auf dem Markt befindlichen Ziegenkäse nicht deklarierte Zusätze von Kuhmilch aufwies. Orientierende Untersuchungen zum speziesspezifischen Nachweis des cytb-Gens in Milch der Tierarten Ziege, Schaf, Büffel, Kamel, und Pferd wurden unter Verwendung von Oligonukleotidprimern durchgeführt. Mit Einschränkung hinsichtlich einer nicht völligen Speziesspezifität ist mit diesem Verfahren eine Tierartendifferenzierung in Milch möglich. A DNA based identification system on species-specific oligonucleotide primers was performed, amplifying the bovine cytochrome b gene for the detection of adulteration of bovine milk in dairy goat products, regardless of whether the milk is processed or not. For DNA extraction a method described by ROMERO und LOPEZ-GONI (1999) with use of a NET-buffer was performed. Four separate DNA extracts of every sample were used in a PCR with a pair of universal primers, after a suitable sample volume of milk and cheese had been determined. Molecular methods based on universal primer for the cytb-gene and subsequent restriction-fragment-length-polymorphism were extensively tested. These proved to be inappropriate as they frequently showed wrong negative results in mixtures of cow s and goat s milk. Some methods for the direct proof of the cytb-gene with the use of species-specific primers were tested as well. It was possible to establish a system which provides a simple and accurate approach to detect as low as 1 % bovine milk in caprine milk and cheese. 165 samples of goat s milk and cheese purchased from supermarkets were analyzed to evaluate the applicability of the method to dairy products from the retail trade. It was shown that a considerable part of the products (13%) contained non-declared bovine milk. Further investigations for the species-specific detection of cytb-gene in milk from sheep, buffaloes, horses and camels with oligonucleotide primers were tested. This procedure proves that, although it must be acknowledged that complete species-specifity is not given, it is possible to differentiate between types of animal by milk.