Attenuierung von Pestiviren durch gezielt ins Genom eingeführte Mutationen : In vitro und in vivo Experimente mit CSFV und BVDV

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt in vitro und in vivo Studien, mit denen der Einfluß verschiedener Punktmutationen in Pestivirusgenomen auf die Virulenz der Erreger und deren Fähigkeit zur diaplazentaren Infektion von Föten in trächtigen Tieren untersucht werden sollte. Dabei wurden Versuche mit dem Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) und dem Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) durchgeführt. Angriffspunkte für die Mutationen waren die Genombereiche, die für das als RNase fungierende Strukturglykoprotein Erns und die Protease Npro kodieren. Für CSFV wurde das Verhalten der RNase-negativen Mutante W300G untersucht. Diese Mutante ist zwar in der standardmäßig verwendeten permanenten Schweinenieren-(SK6)-Zellinie stabil, revertiert aber in infizierten Tieren umgehend zu wt Virus. Diese Reversion erfolgte so schnell, daß die Mutante in Proben aus infizierten Tieren nie nachweisbar war. Die Reversion scheint offensichtlich Zell-spezifisch zu sein, da auch in zwei Linien von Gewebekulturzellen die Restauration der Wildtypsequenz beobachtet werden konnte. Die RNase-negative CSFV Mutante H346deletion, für die in früheren Versuchen gezeigt wurde, daß sie im infizierten Tier keine nennenswerte Virämie erzeugt, wurde in einem Experiment mit trächtigen Schweinen daraufhin untersucht, ob sie zu einer diaplazentaren Infektion der Föten fähig ist. Dabei zeigte sich, daß die RNase Mutation nicht ausreicht, die Infektion der Föten zu verhindern. Weiterhin wurde versucht, nähere Informationen über das Wirkprinzip der Erns-RNase zu erhalten, indem Schweine mit einem RNase-negativen Virus infiziert und die RNase in trans durch ein Vektor-Virus zur Verfügung gestellt wurde. Ziel dieses Versuches war, zu überprüfen, ob durch Supplementierung der RNase die attenuierendeWirkung der RNase-Mutation im Virus aufgehoben werden kann. Diese Versuche führten nicht zu einer klaren Aussage, weil vermutlich die in trans bereitgestellte Menge an RNase nicht ausreichte oder das Protein seinen Zielort nicht erreichte. Um diese Probleme lösen zu können, wurden Versuche unternommen, die RNase in vitro zu exprimieren und zu reinigen. Drei verschiedene Expressionssysteme wurden getestet, die sich aber aus unterschiedlichen Gründen alle als nicht tauglich erwiesen. Zur Klärung der strittigen Frage, ob die Deletion des Proteins Npro zu einer Attenuierung des CSFV führt, wurde ein Tierexperiment mit einer Npro Deletionsmutante des CSFV durchgeführt. Trotz heterogenen Verlaufs der Erkrankungen bei den einzelnen infizierten Tieren war offensichtlich, daß die verwendete Deletionsmutante anders als ähnliche in der Literatur beschriebene Mutanten nicht apathogen ist. Dieses Ergebnis bestätigte die Daten aus früheren Experimenten in unserem Labor. Die drei BVDV-2 Mutanten XIKE-B (Erns RNase-negativ), XIKE-A-NdN (Npro-deletiert) und XIKE-B-NdN (Erns RNase-negativ und Npro-deletiert) wurden in Experimenten mit trächtigen Tieren auf ihre Fähigkeit zur diaplazentaren Infektion der Föten untersucht. Dabei zeigte sich, daß die beiden Einzelmutanten im Gegensatz zur Doppelmutante eine persistente Infektion in den Föten etablieren können. Parallel dazu wurden Studien durchgeführt, die der Überprüfung der Vakzinierungseffizienz dieser Mutanten dienten. Diese Versuche ergaben Hinweise darauf, daß XIKE-B eine protektive Immunität gegen BVDV-1 und BVDV-2 induzieren kann, während Vakzinierung mit XIKE-B-NdN nur vor den Folgen einer BVDV-2 Infektion schützt. The present thesis describes in vitro and in vivo studies to analyse the influence of different point mutations in pestiviral genomes on the virulence of the viruses and their ability to establish diaplacental infection of foetuses in pregnant animals. Experiments with classical swine fever virus (CSFV) and with bovine virus diarrhoea virus (BVDV) were conducted. Targets for mutations were those genome areas that encode structural glycoprotein Erns, acting as a RNase, and protease Npro. In case of CSFV, behaviour of RNase-negative mutant W300G was examined. This mutant is stable in routinely used permanent swine kidney (SK6) cell line, but reverted almost instantly to wt virus in infected animals. The reversion happened so fast that mutant virus was not detectable in samples of infected animals. This reversion was apparently cell specific, as restauration of wildtype sequence could be observed in two tissue culture cell lines. Earlier experiments showed that RNase-negative CSFV H346deletion does not induce noteworthy viremia in infected animals. This mutant was examined in an experiment with pregnant sows for its abilitiy to establish diaplacental infection of foetuses. Thereby it was shown that the RNase mutation is not sufficient to prevent fetal infection. Furthermore, it was tried to gather more information concerning the detailed function of Erns-RNase. To this end, pigs were infected with RNase-negative virus and the RNase was supplemented in trans via a vector virus. Purpose of this experiment was to test, if supplementation of the RNase could abrogate the attenuating effect of the RNase mutation in the virus. This experiment yielded no conclusive answer, probably because in trans delivered RNase did not suffice, or because the protein did not reach its site of action. To solve these problems, experiments were accomplished to express and to purify the RNase. Three different expression systems were tested, but each of them proved not to be suitable for varying reasons. To clarify the question in dispute if deletion of protein Npro leads to attenuation of CSFV, an animal experiment with a Npro deletion mutant of CSFV was conducted. Despite heterogeneous course of disease in individual infected animals, the used deletion mutant was obviously not apa thogen, in contrast to similar mutants described in literature. This result confirmed data of earlier experiments in our labaratory. The three BVDV-2 mutants XIKE-B (Erns RNase-negative), XIKE-A-NdN (Npro-deleted) and XIKE-B-NdN (Erns RNase-negative and Npro-deleted) were examined in an experiment with pregnant animals to investigate if they were able to establish diaplacental infection of foetuses. It was shown that both single mutants, in contrast to the double mutant, were able to establish persistent infection in foetuses. In parallel, studies were accomplished to control vaccination efficiency of these mutants. The experiments indicated that XIKE-B is able to induce protective immunity versus BVDV-1 and BVDV-2, while vaccination with XIKE-B-NdN protects only versus BVDV-2 infection.