Endotheliale Wirkmechanismen von rekombinantem aktiviertem Protein C : Am Beispiel von Fractalkine,Transforming Growth Factor-beta 2 und Cyclooxygenase-2

Abstract

Aktiviertes Protein C hat neben seinen antikoagulativen, profibrinolytischen, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften noch zusätzlich Wirkungen, die insbesondere im Rahmen der Sepsistherapie von wichtiger Bedeutung sein können. APC nimmt damit einen wichtigen Platz im Wechselspiel zwischen Entzündung und Gerinnung ein. Studien an Patienten mit schwerer Sepsis haben gezeigt, dass die Behandlung mit rhAPC die Mortalität senkt. Diese günstige Wirkung von APC kommt unter anderem durch eine Modulation der Genexpression von verschiedenen Mediatoren in einer Vielzahl von Zellsystemen zustande. Die direkte antiinflammatorische Wirkung des APC wurde jedoch bisher nur in vitro gefunden. Eine eindeutige antiinflammatorische Wirkung des APC in vivo ist bis zu diesem Zeitpunkt nicht messbar gewesen. Umso mehr ist es von Interesse, die einzelnen Wirkmechanismen, über die APC seine protektive Wirkung in der Sepsis entfaltet, näher zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mittels Affymetrix®-Genarray mögliche Angriffsorte von aktiviertem Protein C (APC) auf die endotheliale Genexpression aufgedeckt. Hierbei ergaben sich einige funktionell wichtige Zytokine, Chemokine und Mediatoren des Prostaglandinhaushalts die durch APC in ihrer Expressionsrate moduliert wurden. Hierzu gehörten das Chemokin Fractalkine, der Wachstumsfaktor und Immunmodulator Transforming Growth factor-ß2 und die im Prostanoidstoffwechsel bedeutsame Cyclooxygenase-2 (COX-2). Nach ersten Screening-Experimenten wurden Bestätigungsexperimente auf messenger-RNA-Ebene und Proteinebene durchgeführt, beteiligte Rezeptoren und intrazelluläre Mechanismen näher untersucht, und es wurde in der Diskussion der Arbeit auf die mögliche funktionelle Relevanz der beobachteten Veränderungen eingegangen. Für das Chemokin Fractalkine konnte in Übereinstimmung mit den Resultaten aus dem Affymetrix®-Genarray eine zeit- und konzentrationsabhängige Steigerung der endothelialen mRNA und des Proteins unter dem Einfluß von APC gezeigt werden. Es wurde festgestellt, dass nur das aktivierte Protein C eine Wirkung auf die Fractalkine-Synthese und -Freisetzung ausübt. Der Einsatz des Zymogens Protein C bewirkte keine Veränderungen auf die Fractalkine-Freisetzung. Es konnte ermittelt werden, dass APC seine Wirkung auf die vermehrte Fractalkine-Expression ausübt, indem der Protease-aktivierbare Rezeptor-1 aktiviert wird. Eine Beteiligung des PAR-2 konnte ausgeschlossen werden. Im Weiteren wurde die Wirkung von APC auf den Wachstumsfaktor und Immunmodulator TGF-ß2 mit Hilfe von rtPCR und Immunoassay genauer betrachtet. APC bewirkte eine Steigerung der mRNA und auch der Proteinfreisetzung von TGF-ß2 aus humanen Endothelzellen. In folgenden in vitro-Versuchen an humanen Endothelzellen (HUVEC) wurden Mediatoren des Prostaglandinhaushalts untersucht: RhAPC bewirkte eine Steigerung der endothelialen Expression von COX-2-mRNA und COX-2-Protein. Der erhöhte endotheliale COX-2-Proteingehalt bedingte eine verstärkte Freisetzung des Syntheseprodukts Prostazyclin. Die Expression der konstitutiven COX-1 und der Prostaglandin-I2-Synthase (PGIS) wurde durch APC nicht beeinflusst. Das nicht aktivierte Protein C hatte keinen Effekt auf die COX-2-Expression. Durch blockierende Antikörper gegen den PAR-1 (Protease-aktivierbarer Rezeptor-1) konnte ermittelt werden, dass APC sehr wahrscheinlich die COX-2-Expression in HUVEC durch Signaltransduktion über den PAR-1-Rezeptor moduliert. Wie bereits zuvor gezeigt, liegt die funktionelle Bedeutung einer gesteigerten COX-2-Expression und Prostazyclin-Synthese in der Verbesserung der Mirkrozirkulation, der Reduktion der Kapillarpermeabilität, einer zytoprotektiven und plättchenaggregations-hemmenden Wirkung sowie der Reduktion der Zytokinfreisetzung aus aktivierten Monozyten. Die klinische Bedeutung der hier beschriebenen und diskutierten Wirkmechanismen von APC sollte kritisch betrachtet werden, da meist supratherapeutische Dosierungen von rhAPC eingesetzt wurden. Dennoch sind derartige Zellkulturuntersuchungen wichtig, um orientierende Hinweise auf die molekularen Wirkmechanismen einer pharmakologisch wirksamen Substanz zu bekommen. Weitere in vivo Untersuchungen müssen klären, ob die hier vorgeschlagenen Mechanismen auch in vivo von Bedeutung sind und für die günstigen Wirkungen von rhAPC auf das Überleben von Patienten mit schwerer Sepsis verantwortlich gemacht werden können. In addition to its anticoagulant, profibrinolyic, anti-inflammatory and antiapoptotic properties activated protein C exerts activities, which can be of importance in the therapy of sepsis. Therefore APC has an important role in severe sepsis, which is characterized by an imbalance in hemostasis resulting in widespread coagulopathy and microvascular thrombosis. Treatment with rhAPC in patients with severe sepsis resulted in a reduction in mortality. This effect of APC is realized by a modulation of gene-expression of different mediators in a multitude of cells. From in vitro examinatons it has been suggested that APC exhibits anti-inflammatory properties whereas in clinical trials systemic anti-inflammatory effects are still missing. Due to that there is an interest and need to define the properties of APC in detail, which contribute to its protective activity in sepsis. Whithin this doctoral thesis the effects of APC were screened by using Affymetrix microarrays. By the use of these microarrays it was possible to demonstrate, that APC modulates the expression rate of some important functional cytokines, chemokines and mediators of prostaglandin-synthesis.Important examples modulated by APC in their gene expression rate were the chemokine fractalkine, the growth factor and immune modulator transforming growth factor-ß2 and the cyclooxygenase-2 (COX-2), which is an important enzyme for prostaglandin-synthesis. After screening-experiments with microarrays had been performed, positive results were verified on mRNA- and protein-levels. In addition to that receptors and intracellular mechanisms possibly involved were examined and their functional relevance was discussed whithin the discussion section of this doctoral thesis. In accordance with gene-array results APC stimulated fractalkine-messenger RNA-gene transcription and release of fractalkine protein in a time- and dose-dependent manner. It was demonstrated that only activated protein C has an effect on the fractalkine synthesis. The zymogen Protein C had no influence on the release of fractalkine protein. In endothelial cells, most signalling responses of APC are mediated by the protease-activated receptor-1 (PAR-1). Here it was possible to prove an involvement of PAR-1 for APC-induced fractalkine release. A participation of a protease-activated receptor-2 (PAR-2) could be excluded.Furthermore the effect of APC on the growth factor and immune modulator TGF-ß2 was detected by the methods of rtPCR and immunoassay. APC stimulated TGF-ß2-messenger RNA-gene transcription and release of TGF-ß2-protein from human endothelial cells. In the following in vitro experiments performed with human endothelial cellc (HUVEC) several mediators of the prostaglandin-synthesis were examined: An upregulatory effect of rhAPC on mRNA-expression and on protein-synthesis of COX-2 was detectable. The increased endothelial COX-2-level was responsible for an increased release of prostacyclin. The expression of constitutive COX-1 as well as prostaglandin-I2-synthase (PGIS) were not influenced by APC. Moreover protein C had no effect on COX-2-expression. It was demonstrated that the ability of rhAPC to induce an upregulation of COX-2-expression was mediated by PAR-1. This was shown by blocking PAR-1 with an anti-PAR-1-antibody. As published before an increased COX-2-expression and consecutively the upregulation of prostacyclin-synthesis improves the microcirculation, reduces capillar permeability, has a cytoprotective effect, inhibits platelet aggregation and results in a reduction of cytokine-release from monocytes. The clinical relevance of the present results obtained at supra-therapeutic rhAPC concentrations must be judged cautiously. Nevertheless these in vitro data may lead to a better understanding of the multiple biological activities of rhAPC. Further in vivo examinations are needed to clarify, wether in vitro observed effects are of importance under clinical conditions and how these beneficial effects of rhAPC contribute to the survival of patients with severe sepsis.