Replikation von drei Säuger-Hepadnaviren im Amerikanischen Waldmurmeltier (Marmota monax) und Expression der viralen Oberflächenproteine in transgenen Pflanzen

Abstract

Die Infektion von Waldmurmeltieren der USA (woodchucks) mit Hepadnaviren ist ein wichtiges Modell für die Hepatitis B Infektion des Menschen. Hepadnaviren sind sehr speziesspezifisch, z.B. kann das Virus des Menschen nicht Woodchucks infizieren. Daher war es von Interesse zu prüfen, ob Hepadnaviren aus verwandten Nagetieren in Woodchucks eine Infektion auslösen und wie diese verlaufen würde. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die speziesübergreifende Infektion von adulten Amerikanischen Waldmurmeltieren (Woodchucks, Marmota monax) mit den artfremden Virusspezies GSHV des Erdhörnchens (Ground Squirrels, Spermophilus beecheyi) sowie ASHV des Arktischem Hörnchens (Arctic Squirrel, Spermophilus parryi kennicotti) gezeigt werden. Mit Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) inokulierte Woodchucks dienten als Kontrollgruppe. Trotz gleicher Inokulationsdosis und unabhängig von der Virusspezies variierten die individuellen Infektionsverläufe stark hinsichtlich Intensität und Dauer der Virämie und Antigenämie. Bei den hoch replikativen Tieren wurden noch höhere Virus- und Antigenkonzentrationen als bei der akuten Hepatitis B des Menschen erreicht. Im Gegensatz zur menschlichen Hepatitis B war eine sehr rasche Eliminierung des Antigens aus dem Serum innerhalb von 1-2 Wochen und eine langsame Eliminierung des Virus, die bis zu vier Monate dauerte, zu beobachten. Bei allen Tieren konnte während der Viruselimination eine Reduktion der Virus-DNA im Serum um einige Zehnerpotenzen detektiert werden, bevor ein deutlicher Anstieg der leberspezifischen Enzyme (Sorbitol-Dehydrogenase, SDH) eine hepatozelluläre Schädigung erkennen ließ. Die vollständige Eliminierung des Virus war mit der Normalisierung der pathologischen SDH-Konzentrationen assoziiert. Die Detektion von Oberflächenantigen-Immunkomplexen kurz nach Erreichen der maximalen Virämie und Antigenämie zeigt, dass Antikörper gegen die viralen Hüllproteine (S, M, L) direkt an der Eliminierung viraler und subviraler Partikel beteiligt sind. Die individuellen Infektionsverläufe bei gleicher Inokulationsdosis lassen vermuten, dass ähnlich wie beim Menschen der Zeitpunkt und die Qualität der antiviralen Immunantwort jedes Individuums den Verlauf der Virusreplikation und letztendlich die Terminierung der Infektion determinieren. Desweiteren konnten die Proteinmuster der Oberflächenproteine von GSHV und ASHV charakterisiert werden. Sowohl das S-, M- als auch L-Protein der beiden Virusspezies erwiesen sich hinsichtlich ihrer Proteinstruktur als nahezu identisch mit den Oberflächenproteinen von WHV. Lediglich das M-Protein von ASHV wies eine differente Struktur auf, welche möglicherweise mit einem speziellen Glykosilierungsmuster assoziiert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die therapeutische Applikation von kombinierten DNA- und Immunkomplexvakzinen einen deutlich reduzierenden Effekt auf die Antigenämie bei chronisch WHV-infizierten Woodchucks hat. Während der Therapie war eine Abnahme der WHsAg-Konzentration um 70-90% zu verzeichnen. Die Applikation von DNA-Vakzinen allein beeinflusste den Antigenverlauf ebenfalls, wenn auch weniger effizient. Ein weiteres Impfstoffkonzept zur Prävention der HBV-Infektion sieht die Generierung von Subunit-Vakzinen in essbaren Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden HBsAg- und WHsAg-codierende Plasmide in Karotten- und Tabakzellen transformiert und anschließend die Expression der subviralen Partikel in den Pflanzen untersucht. Während sich HBsAg-Partikel eindeutig in Karotten-zellkulturen nachweisen ließen, konnten WHsAg-Partikel weder in Karotten- noch in Tabakzellkulturen detektiert werden. Jedoch ließ sich in einzelnen Tabak-Klonen MWHs-mRNA nachweisen. In den HBsAg-Karottenzellkulturen konnten Expressionsraten von 12-15 µg HBsAg pro g Karottenzellpellet ermittelt werden. The infection of woodchucks with hepadnaviruses is an important model for the human hepatitis B virus infection. Hepadnaviruses are very species-specific, e.g. does the human virus not infect woodchucks. Therefore, it was of interest to study whether and how hepadnaviruses from related rodents could establish an infection in woodchucks. In the present work, the infection of adult woodchucks (Marmota monax) with two viruses that naturally infect other species (GSHV from ground squirrels, Spermophilus beecheyi and ASHV from arctic squirrels, Spermophilus parryi kennicotti) was demonstrated for the first time. Woodchucks experimentally infected with Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) served as controls. Despite using the same dose of inoculum, and independent of the virus species inoculated, the course of infection varied strongly in individual woodchucks in regard to the intensity and duration of viremia and antigenemia. Very high concentrations of virus and antigen were reached in the highly replicating animals, higher than in acute HBV infected humans. In contrast to human Hepatitis B a very rapid occurring clearance of antigen from serum within 1-2 weeks and a slow elimination of virus from serum that lasted up to 4 months were obvious. In all animals a reduction of viral DNA from serum by several decades was detected during the clearance phase, before a significant rise of liver-specific enzymes such as sorbitol dehydrogenase (SDH) indicated hepatocellular impairment. The complete elimination of virus was associated with a decline of SDH activity to normal serum titers. The detection of surface antigen bound to immuno complexes shortly after the peak of viremia and antigenemia in most animals demonstrates the involvement of anti-surface antibodies (anti-s) in the elimination process of viral and subviral particles. The variation in the individual infection courses despite the use of the same dose of inoculum suggests that especially the time point and the quality of the individual immune response determines inhibition of virus replication leading to the termination of infection. Furthermore the pattern of GSHV and ASHV surface proteins was characterized. The protein structure of the S-, M- and L-proteins from both virus species was nearly identical to the surface proteins of WHV. Only the M-protein of ASHV revealed a different structure that perhaps is associated with a special form of glycosylation of this protein. Moreover, it was reported recently that the combined therapeutic application of DNA- and immuno complex-based vaccines reduced significantly the serum antigen concentration in chronic WHV carrier woodchucks. During the above therapy, a reduction of serum WHsAg of approximately 70-90% was observed. The application of DNA-based vaccines alone also had an effect on antigen concentration but this was less pronounced. Another vaccination concept for the prevention of HBV infection is the generation of subunit vaccines in edible plants. In the present work, plasmids encoding for HBsAg or WHsAg were transformed into plant cells derived from carrots and tobacco and the expression of subviral particles in these cells was tested subsequently. While particles containing HBsAg could be clearly detected in cell cultures of carrot, WHsAg particles were undetectable in cell cultures of carrot and tobacco. However, in individual clones of tobacco the expression of MWHs mRNA was demonstrated. In cell cultures of carrot expressing HBsAg, protein expression rates between 12 to 15 µg HBsAg per g carrot cell pellet were obtained.