Aufnahme und Funktion von konventionellen, targetisierten und PEGylierten Glucose-Oxidase-Liposomen in NADPH-Oxidase-defiziente Granulozyten: Untersuchungen an Blutzellen und der gp91phox-/-B6 129S6 Cybb tm1din-Maus

Abstract

Bei der septischen Granulomatose (chronic granulomatous disease, CGD) handelt es sich um einen NADPH-Oxidase-Defekt in Phagozyten. Ziel dieser Arbeit war es, durch das Einbringen von Glucoseoxidase-Liposomen (GOL) unter Bildung von Wasserstoffperoxid mit Hilfe von Glucose den oxidativen Burst zu rekonstituieren. Die Aufnahme von verschiedenen markierten Liposomenpräparationen in Phagozyten wurde mittels FACS-Messung überprüft. Am besten geeignet war die Markierung mit 0,5 Mol% Rhodamin-PE. Die 200nm großen, negativ geladenen EPC:EPG:Chol-Liposomen wurden am besten aufgenommen.Die Rekonstitution des oxidativen Bursts in vitro wurde mit Hilfe des DHR-Assays und der Chemilumineszenz-Messung in NADPH- Oxidase defizientem Maus- und Menschenblut bei Inkubation mit GO-Liposomen nachgewiesen. DCGD-Mäuse (gp 91-/-) wurden mit EPC:EPG:Chol:GOL behandelt. Es kam weder zu einer Hochregulierung von Komplementrezeptoren, noch zu Auswirkungen auf den Blutglucosegehalt, das Verhalten oder das Gewicht der Tiere. Nach 24h war GO in Leber und Milz, jedoch in keinem anderen untersuchten Organ nachweisbar. Es wurden große funktionelle Enzymmengen nachgewiesen, jedoch keine Rekonstitution des oxidativen Bursts (DHR-Assay). Bei Infektionsversuchen mit Staph. aureus und Burk. cepacia bestand kein Unterschied im Krankheitsverlauf zwischen behandelter und unbehandelter Gruppe. Die Auswirkung der liposomalen Verkapselung auf die Antikörperbildung wurde mit Hilfe eines neu etablierten ELISAs untersucht. Sie führt zu höheren Antikörpertitern als die Verwendung gelöster GO. Bei der Verwendung von Liposomen als Arzneimittelcarrier ist also die Verwendung eines autologen und somit nicht immunogenen Enzyms anzustreben.Um die Aufnahme von besser sterilfiltrierbaren, kleinen Liposomen in Phagozyten zu ermöglichen, wurde die Oberfläche durch PEGylierte Sojasterole funktionalisiert. Mit der Koppelung von IgG wurde die Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose angestrebt. Albumin diente als Vergleichsprotein. Die proteingekoppelten Liposomen wurden in Vollblut wesentlich besser aufgenommen als die bisher verwendeten Liposomen. Zwischen IgG und Albumin gab es keine nennenswerten Unterschiede im Aufnahmeverhalten. Ohne Serum fand keine Aufnahme statt. Vermutlich spielt die Opsonisierung der Liposomen durch C3b oder IgG bei der Aufnahme eine große Rolle. Mit den Vorstufen für gekoppelte Liposomen EPC:EPG:Chol:PEG-Liposomen wurdenpharmakokinetische Untersuchungen durchgeführt. Ihre Elimination erfolgte um ein vielfaches langsamer als die der bisher eingesetzten Liposomen, wobei der Organgehalt gering blieb. Bei einigen Versuchstieren war der oxidative Burst teilweise rekonstituiert. Im Blutbild der Maus fiel die niedrige Granulozytenzahl (unter 10% der Leukozyten) auf. Dabei decken sich die ermittelten lymphozytären Differentialblutbilder der CGD-Mäuse mit den Literaturdaten für den Wildstamm. Für Granulozyten der verwendeten CGD-Mäuse und des Wildtyps C57Bl6 wurde zudem mit Hilfe von ADVIA-Messungen ein sehr niedriger Myeloperoxidasegehalt nachgewiesen. Es ist also von einer stark reduzierten Bildung der bakteriziden hypochlorigen Säure auszugehen. Das Mausmodell als einziges vorhandenes Knock-out Modell erwies sich deshalb für die Fragestellung dieser Doktorarbeit als nur bedingt geeignet. Wir schlagen die ex vivo Inkubation von autologem Vollblut mit IgG- oder HSA- targetisierten Superoxidbildenden Liposomen mit guter Granulozytenspezifität vor. Als nicht immunogenes Enzym kommt die Xanthinoxidase in Frage. Diese Therapie könnte ihren Platz in der Intensivmedizin und in der Vorbereitungsphase belastender kurativer Therapien finden. Chronic granulomatous disease, (CGD) is a defect in the NADPH-oxidase of phagocytes. We wanted to reconstitute the oxidative burst using glucose oxidase liposomes (GOL). They produce hydrogen peroxide using glucose.Fluorescence labels were used to check the uptake of different preparations of liposomes. Rhodamin was easy to detect with FACS-measurement at a concentration of 0,5 mol%, and the negatively charged EPC:EPG:Chol-liposomes with a diameter of 200nm were taken up best. They also reconstitute the respiratory burst in deficient human and murine blood in vitro, which was shown by DHR-Assays and Chemiluminescence.EPC:EPG:Chol-liposomes were tested using gp91-phox-/--mice. The treatment was tolerated well. The animals showed neither an upregulation of complement receptors nor changes in blood glucose levels or behaviour. After 24h Glucose oxidase was found only in liver and spleen. A sandwich ELISA showed large quantities of glucose oxidase and a direct ELISA showed the production of H2O2. An ELISA was established to examine the influence of liposomal entrapment on immunogentity. The liposomal entrapped GO caused higher antibody titres than pure GO. A human, non-immunogenic enzyme should be used. In vivo EPC:EPG:Chol:GOL did not reconstitute the oxidative burst. Infections caused by Staphylococcus aureus or Burkholderia cepacia did not show any response to the treatment. Small lipomes are easier to sterilize by filtration. But the uptake in phagocytes needs to be triggered by targeting the surface. Proteins were coupled to tresylated soja sterols. IgG was used to induce IgG mediated phagocytosis, albumin served as control. In blood samples protein-coupled liposomes were taken up much better than EPC:EPG:Chol- liposomes. There was no difference between the coupled proteins.Isolated leucocytes in buffer or inactivated serum did not show any uptake. Probably opsonisation by c3b or IgG is important. Pharmacokinetic studies were performed using preliminary stages of coupled liposomes (anchor-liposomes) and EPC:EPG:Chol:PEG-liposomes in cgd-mice. Elimination was several times slower than in conventional liposomes and was biphasic with a stronger decrease within the first hour. The content in the organs was very low. In some animals the oxidative burst was partially restored.For the interpretation of the results of the animal experiments the haemogram of mice is important. Cell counts showed a low granulocyte count (less than 10% of leucocytes). The measured very high lymphocyte counts of cgd-mice were identical with data for the wild type c57bl6. Results of the perox channel of the ADVIA 120 showed a very low myeloperoxidase content of granulocytes in NADPH-deficient and wild type mice. The lower production of bactericidal HOCl will probably make the treatment with GOL less effective. For these reasons, mice as only existing knockout for NADPH-Oxidase turned out not to be a completely suitable model. We suggest a different treatment. Autolog blood should be incubated ex vivo with IgG- or HSA-targeted superoxide-generating liposomes with good specifity for granulocytes. As not immunogenic enzyme xanthin oxidase can be used. The reconstitution of the oxidative burst using enzyme-containing liposomes might be useful in critical care medicine and during preparation for curative but straining therapies.