Die Funktion von Juv-p120 im Verlauf der Infektion mit Litomosoides sigmodontis

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und den Wirkungen eines exkretorisch-sekretorischen Produkts, Juv-p120, aus der Nagetierfilarie Litomosoides sigmodontis, für das eine immunmodulatorische Funktion vermutet wurde. Es handelt sich um ein hochgradig mit über Phosphatbrücken gebundenem Dimethylaminoethanol (DMAE) modifiziertes Molekül mit einer molekularen Masse von ca. 130 kDa. Es wurde von in vitro in proteinfreiem Milieu gehaltenen, 39 Tage alten präadulten Parasiten gewonnen. Es lässt sich mittels eines polyklonalen, in erster Linie gegen die Modifikation gerichteten Antiserums in Form einer Doppelbande im Bereich von 130 - 150 kDa nachweisen. Das Molekül wurde angereichert durch Filtration durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 100 kDa. Die nachfolgenden Untersuchungen wurden teils vergleichend mit Mastomys coucha und BAL/c-Mäusen durchgeführt. In M. coucha betrug die Rückfindungsrate 120 Tage nach quantitativer L. sigmodontis-Infektion 23 %, bei BALB/c-Mäusen 80 Tage p. i. 5 %. Daneben fanden sich bei Mäusen in etwa gleicher Menge tote, abgekapselte Parasiten. M. coucha entwickelten eine ausgeprägte Parasitämie, in den Mäusen ließen sich nur vereinzelt Mikrofilarien nachweisen. Juv-p120 wird von L3, L4 sowie in geringen Mengen von jungen Weibchen synthetisiert und konnte im Blutplasma L. sigmodontis-infizierter BALB/c-Mäuse 31 bis 51 Tage p. i. nachgewiesen werden. Antikörper gegen Juv-p120 ließen sich in infizierten Mäusen ab Tag 14 p. i., in M. coucha ab Tag 35 p.i., in geringen Mengen noch 70 und 160 Tage p. i. nachweisen. Mit angereichertem Juv-p120 (nÜP) immunisierte M. coucha zeigten nach Belastungsinfektion eine tendenziell reduzierte Parasitämie. Die Wurmzahl war nicht beeinträchtigt, doch entwickelten die weiblichen Würmer einen erhöhten Anteil an pathologisch veränderten Embryonen. Bei immunisierten Mäusen ließ sich kein Einfluss auf eine Belastungsinfektion nachweisen. Milzlymphozyten infizierter M. coucha proliferierten anders als die nicht infizierter Tiere nach Stimulation mit ConA in der Präpatenz kaum, in der Patenz und Postpatenz nicht mehr. nÜP induzierte lediglich in der frühen Patenz eine Proliferation. Zellen aus infizierten BALB/c-Mäusen reagierten auf ConA in der frühen Präpatenz und beginnenden Patenz schwächer als nicht infizierte Kontrollen, proliferierten aber dann mit der Infektionsdauer zunehmend nach Stimulation mit nÜP. Die Transkription von Genen, kodierend für IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13, wurde in Milzlymphozyten L. sigmodontis-infizierter BALB/c-Mäuse nach Stimulation mit ConA und nÜP mittels einer semiquantitativen RT-PCR bis 160 Tage p. i. bestimmt. Die Stimulierung mit ConA induzierte in allen Fällen eine gesteigerte Gentranskription, wobei IFNγ-, IL-10- und IL-13-Gentranskripte in der frühen Präpatenz und in der Postpatenz gesteigert waren. IL-2- und IL-4-Gentranskripte waren bei Zellen aus der frühen Präpatenz im Vergleich zu anderen Infektionsphasen eher erniedrigt. Im Fall des IL-5-Gens ließ sich nur in der späten Präpatenz eine erhöhte Transkription nachweisen. nÜP steigerte die Transkription des IFNγ-Gens allenfalls in der Postpatenz, die des IL-2- und IL-4-Gens in der späten bzw. frühen Präpatenz, hatte bei den übrigen untersuchten Genen dagegen kaum einen Einfluss. Um den Einfluss von Juv-p120 und P-DMAE auf die Proliferationsfähigkeit von Milzlymphozyten zu überprüfen, wurden Zellen infizierter M. coucha und BALB/c-Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten p. i. mit ConA im Beisein von nÜP (a), einem synthetischen, Juv-p120-unabhängigen, P-DMAE-modifizierten Peptid (b) sowie (c) dem nicht modifizierten Kontrollpeptid stimuliert. Das letztere Peptid hatte keinen Einfluss auf die Proliferation. Bei M. coucha-Milzlymphozyten ließ sich die Reaktion mit den verwendeten Mengen auch durch nÜP nicht signifikant modifizieren. Das P-DMAE-Peptid steigerte die Reaktion auf ConA in dosisabhängiger Weise bei Zellen aus der Postpatenz, die ansonsten refraktär gegen ConA waren. Maus-Milzlymphozyten wurden dagegen durch das P-DMAE-Peptid nicht in ihrer Proliferation auf ConA-Stimulierung beeinflusst, während nÜP die Reaktion von Zellen aus der Präpatenz supprimierte. Bei Lymphozyten aus der Patenz und Postpatenz führte es zu einer gesteigerten Proliferation. The thesis deals with the synthesis and effects of Juv-p120, a secretory-excretory product of the rodent filaria Litomosoides sigmodontis, which was supposed to act in an immunomodulatory manner. Juv-p120 is a protein of a molecular mass of approximately 130 kDa which is intensely postranslationally modified by dimethyl-aminoethanol (DMAE) bound by phosphate bonds. It was collected from 39 days old, preadult female worms, incubated in protein-free medium. Using a polyclonal rabbit antiserum which was mainly directed against the modification Juv-p120 could be demonstrated by immunoblotting as a double band of 130 - 150 kDa. The molecule was enriched by filtration of the incubation supernatant through a membrane with an exclusion limit of 100 kDa. Subsequent studies were in part performed comparatively in Mastomys coucha and BALB/c mice as experimental hosts. The developmental rate in M. coucha, determined 120 days p. i., was 23 %, in BALB/c mice, determined 80 days p. i., 5 %. In addition mice contained almost the same numbers of dead, encapsulated parasites. M. coucha showed an intense parasitaemia whereas microfilariae in the mice were found only occasionally. Juv-p120 was synthetized by L3 and L4 and, in small amounts, by young female worms and was demonstrated in the blood of L. sigmodontis-infected BALB/c mice 31 - 51 days p. i. Antibodies to Juv-p120 were found in infected mice as early as 14 days p. i. and occurred in M coucha at day 35 p.i. and in low concentration still 70 and 160 days p. i.. M. coucha and BALB/c-mice were immunized with enrichedJuv-p120 (nÜP) and challenged with L3 of L. sigmodontis. Immunized M. coucha, as a tendency, showed reduced parasitaemia levels but numbers of adult parasites, found 120 days p. i., did not differ from controls. However, female parasites contained increased proportions of pathologically altered intrauterine stages. Immunized BALB/c mice did not differ from controls by parasitological data. Spleen lymphocytes of L. sigmodontis infected M. coucha responded to ConA in contrast to uninfected only weakly by prolifertation and were found non-reactive during patency and postpatency. nÜP stimulation induced lymphocyte proliferation only in early patency. Cells of infected mice isolated during prepatency and early patency responded weaker to ConA than non infected controls but later on proliferated increasingly with time after infection. Transcriptions of IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13 genes induced by ConA and nÜP stimulation were studied in infected BALB/c mice up to 160 days p. i. employing a semiquantitative RT-PCR. ConA induced enhanced transcription of the genes tested, whereby increased transcript levels of IFNγ, IL-10 and IL-13 genes were found during early patency and in the stage of postpatency. In case of IL-2 and IL-4 gene transcription was rather decreased during prepatency when compared to other phases of the infection. IL-5 gene transcripts were particularly enhanced in the late prepatency. nÜP caused increased IFNγ gene transcription only in cells isolated during postpatency. IL-2 and IL-4 gene transcripts were enhanced by nÜP during late and early prepatency, respectively. In case of the other genes tested, nÜP was ineffective. To study the influence of Juv-p120 and DMAE on the proliferative capacity of spleen lymphocytes cells were isolated from L. sigmodontis infected M. coucha and BALB/c mice at various dates p.i. and exposed to ConA in the presence of (i) nÜP, (ii) a Juv-p120-independent synthetic P-DMAE-modified peptide and (iii) the non-modified control peptide. The latter peptide did not affect ConA-induced proliferation at all. Also nÜP in the applied concentrations failed to influence the response of M. coucha lymphocytes. However, P-DMAE-peptide increased the proliferative response of spleen cells isolated from postpatent M. coucha which were otherwise non-responsive to ConA in a dose dependent manner. In contrast, the proliferation of mouse lymphocytes was not influenced by P-DMAE-peptide, whereas nÜP depressed the response of mouse lymphocytes, isolated during prepatency, but enhanced the proliferation of cells of patent and postpatent mice which otherwise did not respond to ConA at all.