Zelldifferenzierung und mukoziliärer Transport der Maus bei Gendefizienz der muskarinischen Rezeptoren M1, M2 und M3

Abstract

Neuronales und non-neuronales Azetylcholin (ACh) vermittelt seine Wirkung über muskarinische Rezeptoren (MR). Es gibt bei Tier und Mensch 5 verschiedene MR Subtypen, M1-M5, die alle zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Die Kopplung der MR an ihre bevorzugten G-Proteine löst die weitere Signalkaskade aus und moduliert zahlreiche zelluläre Prozesse. Der Interaktion zwischen ACh und den MR im non-neuronalen cholinergen System wird eine tragende Rolle bei der Zellproliferation, Differenzierung, Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten und der ziliären Funktion zugewiesen. Dies erklärt die große klinische Bedeutung u.a. bei der Behandlung chronischer Atemwegserkrankungen. Während die spezifische Wirkung der MR vor allem an Neuronen, Herzmuskelzellen, Drüsenzellen und glatten Muskelzellen bekannt und ausführlich beschrieben ist, ist die spezifische Bedeutung der verschiedenen im respiratorischen Epithel vorkommenden MR noch weitgehend unbekannt. Das Ziel der Arbeit war das Erforschen der spezifischen Rolle der im Trachealepithel vorkommenden dominanten MR Subtypen M1, M2 und M3. Wegen der mangelnden Selektivität der vorhandenen Agonisten und Antagonisten konnten die bisher veröffentlichten pharmakologischen Untersuchungen die spezifische Rolle der einzelnen Subtypen nicht klären. In dieser Arbeit dienten als Versuchsmodell MR KO-Mäuse, die jeweils defizient für einen Rezeptorsubtyp sind. Bei diesen Tieren ist das jeweilige Gen zur Rezeptorbildung lebenslang ausgeschaltet, so dass gezielt auf die Wirkung der einzelnen Subtypen geschlossen werden kann. Die Tracheen der KO-Mäuse wurden morphologisch und funktionell im Vergleich zu ihrem korrespondierenden Wildtyp (WT)-Stamm untersucht. Veränderungen der Morphologie des Trachealepithels wurden auf immunhistochemischer, licht- und elektronenmikroskopischer Ebene bestimmt und die relative Anzahl der Zelltypen des Trachealepithels gezählt. Zur Austestung der Zilienfunktion wurde die mukosale Partikeltransportgeschwindigkeit (PTG) in einer eigens dafür etablierten Methode gemessen und, mit demselben Versuchsaufbau, die Zilienschlagfrequenz (ZSF) nach Stimulation mit Muskarin (M) und ATP ermittelt. Mit dieser neu etablierten Messmethode ist es möglich, die PTG in der Trachea unabhängig von der Mukusproduktion zu bestimmen. Ohne Beeinflussung der Mukusproduktion kann so direkt auf den Einfluss der verschiedenen MR auf die effektive Transportleistung der zilientragenden Zellen geschlossen werden. Es ergaben sich keine Unterschiede in der Anzahl und Morphologie der zilientragenden, nicht-zilientragenden und der Basalzellen bei M1KO-, M2KO- und M3KO-Mäusen im Vergleich zu ihrem korrespondierenden WT-Stamm. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich ein differenziertes zilientragendes Epithel auch in Abwesenheit der Rezeptorsubtypen M1, M2 und M3 entwickelt. Bei der Messung der PTG in den unterschiedlichen KO-Stämmen konnte gezeigt werden, dass alle 3 untersuchten Rezeptorsubtypen fundamental an der Regulation des Partikeltransportes beteiligt sind. Der M3 Subtyp stimuliert die PTG, während der M2 Rezeptor einen hemmenden Einfluss auf die PTG besitzt. Bei Defizienz des M1 Rezeptors ist die PTG hoch signifikant erniedrigt. Alle 3 Subtypen agieren in ihrer Einflussnahme auf die PTG über unterschiedliche Mechanismen. Der M3 Rezeptor steigert die ZSF und dadurch die PTG, während der M1 und M2 Rezeptor nicht die ZSF beeinflussen. Der Mechanismus, über den es in M1KO-Tieren zu einer Reduktion der PTG und in M2KO-Tieren zu einer gesteigerten PTG kommt, konnte in dieser Arbeit nicht vollständig geklärt werden. Ein Fehlen des M1 Rezeptors verringert möglicherweise die Koordination zwischen den zilientragenden Zellen und könnte über diesen Weg zu einer verminderten PTG führen. Im Gegensatz zu den M1KO- und den M3KO-Tieren zeigen M2M3Doppel-KO-Mäuse keine Unterschiede in der PTG nach Zugabe von ATP im Vergleich zum WT-Stamm. Zusätzlich reagieren sie noch mit einer signifikanten PTG-Steigerung auf die Zugabe von Muskarin. So ist auf der einen Seite durch die Blockierung der M2 und M3 Rezeptorsubtypen eine Bronchodilatation gewährleistet, während auf der anderen Seite die PTG nur minimal herabgesetzt ist, was wichtig für die Aufrechterhaltung der mukoziliären Cleareance ist. Im Hinblick auf ein optimales Rezeptortarget zur Behandlung chronischer Atemwegserkrankungen scheint die selektive Antagonisierung der M2 und M3 Rezeptorsubtypen ohne Interferenz mit dem M1 Rezeptorsubtyp sinnvoll. Both neuronal and non-neuronal acetylcholine (ACh) act via muscarinic receptors (MR). Five different mammalian MR subtypes are known (M1 M5) which all belong to the family of G-protein coupled receptors. Coupling of MR to G-proteins initiates a signal cascade and modulates several cellular processes. Non-neuronal cholinergic signalling via MR is assumed to play an important role in the regulation of cellular proliferation, differentiation, maintenance of cell-cell-contacts and ciliary function. This explains its clinical significance, e. g. in the treatment of chronic airway diseases. While the function of MR in neurons, cardiomyocytes, glandular cells and smooth muscle cells is largely known, a detailed analysis of the different MR in the respiratory epithelium is largely missing. The present study was aimed to determine the specific role of the MR subtypes M1, M2 and M3 in the tracheal epithelium. Since presently available agonists and antagonists are not fully subtype-specific previous pharmacological studies have not been able to clarify this subject. This study was conducted on knockout mice (KO mice) that are genetically deficient for either of these receptor subtypes. Tracheas of these mice and corresponding wild-type (WT) mice were investigated morphologically and functionally. Epithelial morphology was investigated by immunohistochemistry, light- and electronmicroscopy, and the relative frequency of the different cell types was determined. Ciliary function was evaluated by measuring particle transport speed (PTS) and ciliary beat frequency (CBF) in a newly established experimental set up. The effect of stimulation with either muscarine (M) or ATP was evaluated. This experimental approach allows to measure PTS in the trachea independent from mucus production. Thus, it allows to evaluate directly the influence of different MR subtypes on the effective transport capacity generated by the ciliated cells. There were neither differences in the number nor in morphology of the ciliated, non-ciliated and basal cells in M1KO, M2KO and M3KO mice compared to their corresponding WT strains. These data show that a differentiated ciliated epithelium develops in absence of receptor subtypes M1, M2 and M3. PTS measurements revealed that all three receptor subtypes are critically involved in regulation of particle transport. The M3 subtype stimulates PTS while the M2 subtype exerts an inhibitory influence. Deficiency of the M1 receptor leads to a highly significant reduction in PTS. All three subtypes act via different mechanisms. The M3 receptor stimulates CBF and thereby PTS while the M1 and M2 receptor have no influence on CBF. The mechanism that is responsible for the reduction of PTS in M1KO mice or an acceleration in M2KO mice could not be entirely elucidated in this study. Possibly, deficiency in the M1 receptor leads to reduced coordination of ciliary beat, thereby resulting in a reduced PTS. In contrast to M1KO and M3KO mice, M2M3double KO mice responded to stimulation with ATP comparable to the WT-strain. Moreover, muscarine lead in these mice to a significant PTS increase. Translated to the situation and pharmacological treatment in human disease this would mean that combined inhibition of the M2 and M3 receptor will result in bronchodilatation while PTS is minimally reduced which is important for maintenance of mucociliary clearance. Thus, a selective combined inhibition of M2 and M3 receptor subtypes without interference with the M1 receptor subtype appears to be advantageous in the treatment of chronic airway diseases.