Molekularbiologische Untersuchungen am PKD1-Gen der Katze

Abstract

1.Ziel dieser Arbeit war es, eine die PKD in der deutschen Perserkatzenpopulation auslösende Mutation im felinen PKD1-Gen oder einen eng mit dem PKD-Phänotyp gekoppelten Marker zu identifizieren. Auf Grundlage der Ergebnisse sollte ein direkter oder indirekter Gentest entwickelt werden. Weiterhin sollten an der Pathogenese der PKD beteiligte Strukturen des PKD1-Gens ausfindig gemacht werden. 2.Die Literaturübersicht stellt die Erkrankung PKD bei der Perserkatze vor und geht auf den gegenwärtigen Kenntnisstand der Pathogenese der PKD ein. Die ADPKD des Menschen gleicht der PKD der Perserkatze in vielerlei Hinsicht. Daher wird auch diese Erkrankung einschließlich der Pathogenesemechanismen beschrieben. Das letzte Kapitel der Literaturübersicht beschäftigt sich mit dem PKD1-Gen und seinem Genprodukt, dem Polyzystin 1. 3.Für die eigenen Untersuchungen standen DNS-Proben von 166 Katzen und einem Hund zur Verfügung. Bei den Katzen handelte es sich im Wesentlichen um Perserkatzen. Hierunter befanden sich vier Familien mit bekanntem Stammbaum. Die Tiere entstammten dem Patientengut der Klinik für Kleintiere, Abteilung Chirurgie, sowie dem Sektionsgut des Instituts für Veterinär-Pathologie der Justus-Liebig-Universität Gießen. Anhand der ultrasonographischen oder pathomorphologischen Befunde der Nieren erfolgte die Einteilung der Probanden in die Gruppen der zystenpositiven oder ?negativen Tiere. 4.Es wurden eigene Primerpaare für sechs PCR-Systeme aus den Bereichen der erwarteten Exons 4 bis 6, Exon 27 bis 30, Exon 36 bis 40 sowie von Exon 43 des PKD1-Gens bis in den kodierenden Bereich des TSC2-Gens entwickelt. Hinzu kam ein eigenes PCR-System zur Amplifikation von cDNS aus dem Bereich von Exon 29 bis 37. 5.PCR-Amplifikate von zystenpositiven und negativen Probanden wurden nach einer ausführlichen Strukturanalyse teilweise kloniert und sequenziert, teilweise direkt sequenziert, um insbesondere heterozygote Sequenzvarianten identifizieren zu können. Der Homologievergleich zu den entsprechenden PKD1-Sequenzen von Hund und Mensch zeigte die PKD1-spezifische Amplifikation aus feliner DNS. Insgesamt wurden 6.401 Basen an Sequenzinformation des PKD1-Gens der Perserkatze untersucht. Ebenso wie das humane PKD1-Gen liegt auch das feline Gen in Tail-to-Tail-Orientierung zum TSC2-Gen. 43 identifizierte Sequenzvarianten belegten, dass das feline PKD1-Gen ein hochpolymorphes Gen ist. Dies wurde auf den hohen GC-Gehalt von bis zu 81 % in den untersuchten Abschnitten zurück geführt. Die Neigung des PKD1-Gens zu Nukleotidsubstitutionen könnte auch bei der Perserkatze die Gefahr neuer PKD-auslösender somatischer oder Second Hit-Mutationen mit sich bringen. 6.Bei 95 % der zystenpositiven Perserkatzen (73 von 77) lag eine C>A-Transversion im Exon 29 des felinen PKD1-Gens vor, die durch Kodierung eines Stopcodons wahrscheinlich zum vorzeitigen Abbruch der Proteinkette führte. Jedes dieser Tiere war bezogen auf diese Mutation heterozygot. Im Gegensatz dazu war bei allen Tieren ohne nachweisbare Nierenzysten (n = 76) die Mutation im Exon 29 nicht vorhanden. Das Verteilungsmuster in den Familien entsprach dem erwarteten autosomal-dominanten Vererbungsmodus. Mit diesen Ergebnissen konnte die von Lyons et al. (2004) publizierte Mutation im Exon 29 auch in einer Stichprobe deutscher Perserkatzen nachgewiesen werden. Für ein Screening erwies sich die RFLP-Analyse als sehr geeignete Methode. Eine weitere ursächliche Mutation fand sich nicht. Bei 5 % der zystenpositiven Perserkatzen (n = 4) fand sich die C>A-Transversion nicht. Bei diesen Tieren sind andere primäre Nierenerkrankungen, eine weitere Mutation im PKD1-Gen oder Mutationen anderer Gene ursächlich möglich. 7.Alle zystenpositiven Katzen der Rasse Exotic Shorthair (n = 3) waren heterozygot für die C>A-Transversion. Dagegen war keine der zystenfreien Katzen (n = 3) Träger der Mutation. 8.Nur bei 25 % (eine von vier) der untersuchten kurzhaarigen Hauskatzen (EKH) lag eine Assoziation zwischen der PKD und der Mutation im Exon 29 vor. Bei einer Katze der Rasse Russisch Blau mit einer Einzelzyste, bei einer Mischlingskatze mit Teleangiektasien in der Leber sowie bei einer Perserkatze ohne Nierenzysten, dafür aber mit multiplen Leberzysten, war die bekannte Mutation ebenfalls nicht die Ursache der Veränderungen. 9.In der untersuchten Stichprobe der Perserkatzen befanden sich keine homozygoten Merkmalsträger, was für die untersuchte Mutation als Letalfaktor spricht. 10.Die Ergebnisse der Ultraschalluntersuchung von Perserkatzen auf Nierenzysten und des Gentests wurden miteinander verglichen. Betrachtet man alle untersuchten Perserkatzen stimmte zu 97,4 % der positive bzw. negative Zystenbefund mit dem positiven bzw. negativen Ergebnis des Gentests überein. Der Nachweis der Erblichkeit der PKD ist im Gegensatz zur Ultraschalluntersuchung mit dem Gentest möglich. 11.Amplifikate des Genabschnitts von Exon 4 bis 6 zeigten unterschiedliche gelelektrophoretische Laufeigenschaften, die vermutlich durch Konformationsvarianten entstanden. Die Sequenz von Intron 4 weist einen Inverted Repeat sowie einen G-reichen Repeat auf, die durch gegenseitiges Annealing und Mismatches Sekundärstrukturen in Form von Schleifen auslösen könnten. Zusätzlich wurden Fragmente dieses Abschnittes isoliert, die zwischen den genannten Repeats eine Deletion von 139 Basen aufwiesen. Es handelte sich nicht um ein Allel des PKD1-Gens, sondern um ein unregelmäßig nachweisbares Phänomen. Der Verlust von 139 Basenpaaren eines Introns könnte zu Defekten während des Spleißens und damit zu einem Funktionsverlust des Proteins führen. Sollte Intron 4 auch in vivo eine Prädilektionsstelle für Deletionen sein, könnte diese Besonderheit einen möglichen Second Hit in der Pathogenese der PKD verursachen. 12.Im felinen Ovar konnte gespleißte mRNS des PKD1-Gens nachgewiesen werden. Bisher gab es keine Berichte über die natürliche Expression des PKD1-Gens im Ovar. 1.Purpose of this study was to identify a mutation which causes PKD in the German Persian cat population or, alternatively, to find microsatellite markers with linkage to the PKD phenotype to develop a method of direct or indirect genetic testing based on these findings. Furthermore, it was attempted to find structures within the PKD1 gene which are involved in the pathogenesis of PKD. 2.The literature review summarises the current state of knowledge concerning PKD in Persian cats and the pathogenesis of PKD. Because of the high similarity between PKD in cats and ADPKD in humans, features of ADPKD and its pathogenesis are described. The last chapter deals with the PKD1 gene and its gene product Polycystin 1. 3.Own investigations were performed on DNA samples of 166 cats, particularly Persian cats including four families, and a dog. Samples were collected from patients of the Clinic for Small Animals and from dissected cats of the Institute of Veterinary Pathology, Justus-Liebig-University, Giessen.Cats were classified as positive or negative for renal cysts based on the results of ultrasound or pathomorphological examination of the kidneys. 4.Six PCR primer sets were designed for amplification of exon 4 to exon 6, exon 27 to exon 30, exon 36 to 40 and exon 43 of the PKD1 gene into the coding region of the TSC2 gene. Additionally, an own primer set for amplification of cDNA including exon 29 to exon 37 was used. 5.The gene structure of these fragments was analysed. Afterwards, PCR products of cats with and without renal cysts were cloned and sequenced or direct sequencing was used to identify heterozygous mutations. The sequences were homologous to the PKD1 genes of dog and human. A total of 6,401 base pairs of the feline PKD1 gene were analysed. Like their human counterparts the putative feline TSC2 and PKD1 genes are arranged in a tail-to-tail orientation. 43 identified variants in the feline PKD1 sequence show its high polymorphic nature. It might originate from the high G/C content up to 81 % in the investigated regions. Tendency of nucleotide substitution in the PKD1 gene might be predisposing for new PKD causing somatic mutations or second hit mutations in Persian cats. 6.95 % of the affected Persian cats (73 of 77) showed a C>A transversion in exon 29 of the feline PKD1 gene resulting in a premature stop codon and loss of a large part of the protein. In all cases the mutation was found in the heterozygous state. None of the unaffected cats (n = 76) displayed the mutation. In the families the mutation correlated with the autosomal dominant mode of inheritance. Previous studies have identified the same mutation (Lyons et al., 2004). This mutation also occurs in the German Persian cat population. RFLP analysis is an appropriate method for a screening. No other causative mutation was found. The mutation was absent in 5 % of the affected Persian cats (n = 4). In these cases the disease might be caused by a primary renal disease, another mutation of the PKD1 gene or mutations of other genes. 7.All affected exotic shorthair cats (n = 3) showed the mutation in the heterozygous state. No unaffected cat (n = 3) displayed the mutation. 8.25 % of examined domestic shorthair cats (one of four) had renal cysts associated with the mutation in exon 29. The mutation in exon 29 was not found in one cat (Russian Blue) exhibiting an single renal cyst in one kidney, a hybrid cat with teleangiectasias of the liver and a Persian cat with multiple liver cysts but without renal cysts. 9.The homozygous mutation seems to be a lethal factor since only heterozygous cats were present in the population investigated. 10.The results of ultrasound examination for renal cysts in Persian cats were compared to the results of genetic testing. Presence or absence of renal cysts was concordant with a positive or negative test result in 97.4 %. Genetic testing is capable to attest inheritance of the disease in contrast to ultrasound examinations. 11.PCR products of exon 4 to 6 showed variable electrophoretic mobility most likely generated by presumed conformation variants. Intron 4 contains an inverted repeat and a G-rich repeat which are capable to form hairpin loops due to mismatches in the sequence. Additionally, a fragment was isolated with a deletion of 139 bp between these repeats. It was not an allele of the PKD1 gene but an infrequently occurring finding. Loss of intronic 139 bp might cause failures in Pre-mRNA splicing and therefore results in defective protein function. Intron 4 could be predisposed for deletions in vivo and produce second hits in the pathogenesis of PKD. 12.Spliced mRNA of the PKD1 gene was found in the feline ovary. To our knowledge this is the first report of expression of the PKD1 gene in the ovary.