Die Bedeutung der Area postrema als zentralnervöser Sensor für inflammatorische Signale

Abstract

Die Area postrema (AP) gehört zu den sensorischen zirkumventrikulären Organen, die durch eine unvollständige Blut-Hirn-Schranke gekennzeichnet sind und liegt in direkter Nähe zum vierten Ventrikel. Die Expression von Toll-like Rezeptoren (TLRs) zur Erkennung bestimmter Pathogen-assoziierter Molekülstrukturen (PAMPs) und Rezeptoren zur Erkennung von proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. Tumor Nekrose Faktor-a (TNF-a) und Interleukin-1b (IL-1b) innerhalb der AP machen dort eine direkte Interaktion von PAMPs oder Zytokinen mit zellulären Strukturen möglich. Um eine potentielle PAMP- oder Zytokin-induzierte zelluläre Aktivierung näher zu untersuchen, wurde eine primäre Zellkultur der AP der Ratte etabliert. Hierzu wurde das topographisch exakt präparierte Hirngewebe von 3-4 Tagen alten Ratten verwendet. Zum ersten Mal wurde die Fura-2 Ratio-Imaging-Technik genutzt, um PAMP-induzierte Kalziumsignale in einer AP Zellkultur, stimuliert durch Lipopolysaccharid (LPS), Muramyldipeptid (MDP), Fibroblasten-stimulierendes Lipopeptid-1 (FSL-1) oder Polyriboinosin:Polyribocytosinsäure (PI:PC) näher zu charakterisieren. Das Resultat dieser Studie ergab eine niedrige Responsivität von Neuronen (3%), Astrozyten (2%) und Oligodendrozyten (1%), jedoch antworteten 10-12% der untersuchten Mikrogliazellen mit einem Anstieg der [Ca2+]i als Reaktion auf eine Stimulation mit LPS, nicht aber mit MDP oder FSL-1. Die Stimulation mit PI:PC hingegen aktivierte 8% der untersuchten Neurone und 2% der Astrozyten, hatte aber keinerlei Einfluss auf die [Ca2+]i der Mikrogliazellen. Mit Hilfe spezifischer Bioassays konnte in den Überständen von LPS-stimulierten AP Zellkulturen eine beachtliche Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-a und IL-6 nachgewiesen werden, die eine Zeitabhängigkeit aufwies. Eine erhöhte Expression von immunreaktivem TNF-a konnte eigens nur im perinukleären Trans-Golgi-Aparat von AP Mikrogliazellen detektiert werden. Auch die Stimulation der AP Kulturen mit FSL-1 und PI:PC hatte eine erhöhte Freisetzung von bioaktivem TNF-a und IL-6 in den Kulturüberstand zur Folge, die aber wesentlich moderater ausfiel, verglichen mit der Zytokinfreisetzung nach LPS-Stimulation. Die Vorinkubation der AP Zellkultur für 18 Stunden mit LPS führte zu einer vollständigen Unterdrückung von LPS-induzierten Ca2+-Signalen und zu einer starken Abschwächung der LPS-induzierten Zytokinsekretion der AP Zellen. Der Nachweis einer direkten zellulären Antwort auf eine LPS-Stimulation, insbesondere von AP-intrinsischen Mikrogliazellen, führt zu der berechtigten Annahme, dass die AP als Sensor für zirkulierende PAMPs, vor allem aber den TLR-4-Agonisten LPS, agiert. Die Unterdrückung der LPS-abhängigen Responsivität der Mikrogliazellen nach Vorinkubation der AP Zellkultur mit LPS, nicht aber mit MDP oder FSL-1, lässt die Enstehung einer spezifischen Endotoxin-Toleranz innerhalb der AP vermuten. Die Applikation von TNF-a, IL-1b oder dem Stickstoff-Monoxid (NO)-Donor Diethylamino-diazenolat-2-oxid (DEA) führte zu einer raschen vorübergehenden Erhöhung der [Ca2+]i bei bestimmten Zellpopulationen der AP Primärkultur. Auf Stimulation mit TNF reagierten 8% aller untersuchten Neurone und Astrozyten und nur vereinzelt Mikrogliazellen und Oligodendrozyten mit einem Anstieg der [Ca2+]i. Hingegen antworten 15% der untersuchten Neurone auf IL-1, während nur 5-7% der restlichen Zelltypen Veränderungen ihrer [Ca2+]i zeigten. Der deutlichste Effekt war nach der Applikation von DEA zu beobachten, wobei mehr als 20% der untersuchten Astrozyten und Oligodendrozyten, 15% der Neurone und 10% der Mikrogliazellen reagierten. Diese Studie beweist, dass die AP als Sensor für zirkulierendes TNF-a, IL-1b, oder für lokal produzierte Zytokine und NO während Infektion und Inflammation, eine bedeutende Rolle spielt. Zusammenfassend kann man feststellen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit ganz klar beweisen, dass die AP als sensorisches zirkumventrikuläres Organ die Fähigkeit besitzt, eine direkte und schnelle zelluläre Antwort sowohl auf exogene, als auch endogene Pyrogene zu entwickeln. Die postulierte Rolle der sensorischen CVOs innerhalb der komplexen Vorgänge der Kommunikation zwischen Immunsystem und Gehirn wird damit weiter untermauert. The area postrema (AP) represents the sensory circumventricular organ lacking endothelial blood-brain barrier function in direct vicinity to the 4th cerebral ventricle. Expression of Toll-like receptors (TLRs) for several pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and of receptors for the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-a (TNF-a) and interleukin-1b (IL-1b) within the AP enables direct interaction of a given PAMP or cytokine with its cellular elements. To study specific PAMP- or cytokine-mediated cellular activation, a primary microculture of the rat AP was established from topographically excised pup brain tissue. The Fura-2 ratio imaging technique was first used to characterize PAMP-induced calcium signaling in AP microcultures stimulated with lipopolysaccharide (LPS), muramyldipeptide (MDP), fibroblast-stimulating lipopeptide-1 (FSL-1) or polyinosinic:polycytidylic acid (PI:PC). With limited responsiveness of neurons (3 %), astrocytes (2 %) and oligodendrocytes (1 %), LPS but not MDP and FSL-1 caused fast transient rises in intracellular calcium concentration [Ca2+]i in 10-12 % of the microglial cells investigated. Stimulation with PI:PC, on the other hand, activated 8% of all neurons and 2.5% of all astrocytes investigated, without any effects on [Ca2+]i in microglial cells. In the supernatants of LPS-treated AP microcultures, a marked time-dependent release of the proinflammatory cytokines TNF-a and IL-6 was determined by use of specific bioassays. Enhanced expression of immunoreactive TNF-a could be detected in the perinuclear Golgi zone of AP microglial cells exclusively. Stimulation of AP-cultures with FSL-1 or PI:PC also caused an increased release of bioactive TNF-a and IL-6 into the supernatant, which was, however, less pronounced when compared to the effects of LPS. Pre-incubation of AP microcultures with LPS for 18 hours caused complete suppression of LPS-induced calcium signaling and strong attenuation of LPS-induced cytokine secretion by AP cells. The demonstration of direct cellular responses predominantly of AP-intrinsic microglial cells to LPS-stimulation raises the intriguing possibility that the AP can act as a sensor for circulating PAMPs, mainly the TLR4-agonist LPS. The lack of microglial responsiveness to LPS by pre-exposure of AP microcultures with this PAMP, but not MDP or FSL-1, suggests AP-intrinsic development of a phenomenon termed endotoxin tolerance . Administration of TNF-a, or IL-1b or the nitric oxide (NO) donor diethylamino-diazenolate-2-oxide (DEA), caused fast transient rises in intracellular calcium concentrations ([Ca2+]i) in distinct populations of cells investigated in the rat AP primary microculture. TNF caused rapid elevations of [Ca2+]i in 8% of all neurons and astrocytes investigated, with limited responses of microglial cells and no responses of oligodendrocytes. 15% of all neurons investigated responded to IL-1, while just 5-7% of the other cell types showed rises in [Ca2+]i. The most pronounced effects were caused by treatment with DEA with more than 20% responding astrocytes and oligodendrocytes, 15% neurons and 10% microglial cells. Evidently, the AP can act as a sensor for circulating TNF and IL-1, or for locally produced cytokines and NO during infection and inflammation. Taken together, the results of this study clearly demonstrate that the AP as one of the sensory circumventricular organs has the capacity to develop direct and immediate cellular responses to putative exogenous as well as endogenous pyrogens. The postulated role for sensory CVOs within the complex array of immune-to-brain communication pathways is thus reinforced.