Der Nucleus praeopticus medianus im Hypothalamus der Ratte als prä-integrative Struktur afferenter Signale zur Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserhaushaltes sowie der Körperkerntemperatur

Abstract

Der in der Lamina terminalis des rostralen Hypothalamus gelegene Nucleus medianus praeopticus (MnPO) innerhalb, sowie das Organum subfornicale (SFO) bzw. vasculosum laminae terminalis (OVLT) außerhalb der Blut-Hirn Schranke spielen eine bedeutende Rolle als sensorische (SFO, OVLT) bzw. sensorisch/integrative (MnPO) neurogliale Einheiten im Rahmen der zentralnervösen Kontrolle des Salz- und Wasser- sowie Wärmehaushalts von Säugetieren wie der Ratte. Einerseits sind Neurone und gliale Zellen von SFO/OVLT für im Blut zirkulierende Ionen und Signalmoleküle wie Hormone frei zugänglich, andererseits stehen beide Einheiten sowie insbesondere auch der MnPO als integrative Komponente des Hypothalamus in ausgeprägter reziprokneuronaler Verbindung mit zahlreichen Kerngebieten des Hypothalamus, des limbischen Systems oder der Medulla oblongata. Neurone des MnPO erhalten dabei neben den osmoregulatorisch relevanten Afferenzen von SFO/OVLT und thermoregu-latorisch bedeutsamen Afferenzen aus der präoptischen hypothalamischen Region wichtige Informationen aus der Peripherie nach deren Vorverarbeitung in Kerngebieten der Medulla oblongata und Pons mit Kreislauf-, Volumen-, osmo- oder thermoregulatorischer Bedeutung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Rolle des MnPO bzw. seiner Zellen im Rahmen der Perzeption dieser afferenten Signale durch den Einsatz Ganztier-physiologischer, immunhistochemischer und zellbiologischer Techniken zu untersuchen. Dazu wurden männliche Wistar-Ratten folgenden Versuchsbedingungen unterzogen, und deren Auswirkung auf Körperkerntemperatur (KT), lokomotorische Aktivität, Trinkwasseraufnahme und Blutparameter als Maß für Änderungen des intravasalen/extrazellulären Flüssigkeitsraums (EZF) untersucht : § Gruppe K: Kontrollgruppe (23°C RT; Trinkwasserzugang) § Gruppe A: Thermische Stimulation (48 h bei 30°C RT; Trinkwasserzugang) § Gruppe B: Thermische Stimulation (48 h bei 33°C RT; Trinkwasserzugang) § Gruppe C: Volumen-Stimulation (PEG-Behandlung; kein Trinkwasserzugang) § Gruppe D: Osmotische Stimulation (23°C RT; 24 h Trinkwasserentzug) Die transkardiale Fixierung des Gehirngewebes unmittelbar nach Beendigung des Tierversuches sollte dann in coronalen Gehirnschnitten denStimulus-spezifischen, immunhistochemischen Nachweis einer Translokation des Transkrip-tionsfaktors Fos in den Kern von Zellen des MnPO sowie OVLT als Parameter einer generellen zellulären Aktivierung ermöglichen. Diese Aktivierung spezifischer Neuronenpopulationen in MnPO (und OVLT) durch extrazelluläre Hypertonizität, Hypovolämie oder erhöhte Umgebungstemperatur führte unmittelbar zur Frage nach den Neurotransmitter-Systemen, welche im Bereich des MnPO an der Verarbeitung der jeweiligen afferenten Signale beteiligt sein könnten. In diesem Zusammenhang wurde dem durch das generierende Enzym neuronale Stickstoffmonoxidsynthase (nNOS) gebildeten, volatilen Botenstoff Stickstoff-monoxid (NO) eine bedeutende Rolle bei der Perzeption und Integration thermo-, osmo- sowie Volumen-regulatorischer Signale aufgrund zahlreicher Literaturdaten zugesprochen. Der Nachweis der nNOS erfolgte ebenfalls immunhistochemisch mit Betonung auf einer zellulären Co-Lokalisation mit Fos. Um eine mögliche efferente Projektion aktivierter, (nicht-)nitrerger MnPO-Neurone in die parvozelluläre Komponente des Nucleus paraventricularis (pPVN) als wichtigstem, integrativen Kerngebiet des Hypothalamus aufzuzeigen, wurde bei den Tieren mit osmotischer Stimulation (Gruppe D) der retrograd transportierte neuronale Tracer true blue (TB) in den pPVN mikroappliziert. Im Hinblick auf die präintegrative Funktion des MnPO als vorgeschaltetem Relais des pPVN sollte in dieser Arbeit also anhand der in vivo Versuchsmodelle untersucht werden, ob im Bereich des MnPO freigesetztes NO eineneuromodulato-rische Funktion im Rahmen der Homöostase des Wasser-, Elektrolyt- und Wärmehaushaltes einnimmt und aktivierte nitrerge MnPO-Neurone Efferenzen zum pPVN aufweisen. Osmotische, von Neuronen des SFO und/oder OVLT zum MnPO übertragene Signale bedienen sich in vivo in erster Linie des Oktapeptids Angiotensin II (AngII) als wichtigstem Neuromodulator, wie vielfach in der Literatur belegt. Änderungen des EZF-Volumens hingegen werden von peripheren Sensoren im Bereich des Niederdrucksystems polysynaptisch über Stukturen der Medulla oblongata an den Hypothalamus, vorrangig den MnPO, übermittelt. Dabei ist Noradrenalin (NA) als finaler Botenstoff zur Übertragung der medullären Signale an den MnPO hauptverantwortlich. Um auf zellulärer Ebene die durch hyperosmolale bzw. hypovolämische in vivo Stimulation induzierte Aktivierung MnPO-intrinsischer Zellen bezüglich der dabei nachgeschalteten intrazellulären Signaltransduktion untersuchen zu kön-nen, wurde eine Primärkultur MnPO-spezifischer Neurone und Gliazellen aus neonatalen Rattengehirnen etabliert. In in vitro Experimenten konnte durch Superfusion der mit Fura-2 AM beladenen Zellen der Primärkultur dieStimulus-abhängige, transiente Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]iz) online erfasst und durch nachfolgende immunzytochemische Charak-terisierung Zelltyp-spezifisch zugeordnet werden. Superfundiertes AngII bzw. Noradrenalin (NA) repräsentierten dabei jeweils die Stimulation MnPO-intrinsischer Zellen durch extrazelluläre Hyperosmolalität respektive Hypovolämie. Bezogen auf die vier Versuchsansatze (A D) wurden folgendeGanztierphysiologische, immunhistochemische und zellbiologische Ergebnisse erzielt : § Die milde Wärmeexposition bei Versuchsgruppe A repräsentierte bei unveränderter Plasmaosmolalität und Na+-Konzentration sowie nur geringfügiger Reduktion des Plasmavolumens einen nahezu reinen thermischen Stimulus. Während der zweiten Nachtphasen bei 30°C RT ergab sich ein signifikanter Anstieg der KT um 0,3 - 0,4°C sowie der Trinkwasseraufnahme im Vergleich zu den entsprechenden Perioden bei 23°C RT, bei unveränderter lokomotorischer Aktivität. Für alle drei Substrukturen des MnPO sowie ausschließlich die dorsal cap des OVLT konnte eine ausgeprägte Aktivierung von Neuronen ermittelt werden, von denen sich lediglich einige in der ventralen Zone des aMnPO als nitrerg erwiesen. Im dMnPO zeigten vor allem nicht-nitrerge Neurone in der lateralen Außenzone, im vMnPO ventrikelnahe, nichtnitrerge Neurone eine nukleäre Fos-Translokation. § Die als Hitzestress zu bezeichnende Wärmexposition bei Versuchsgruppe B repräsentierte aufgrund der erhöhten Werte für Hkt sowie Osmolalität und Na+-Konzentration des Plasmas einen kombinierten thermischen sowie hyperosmotischen und hypovolämischen Stimulus. Sowohl die Nachtphasen beider Versuchstage als auch beide Tagphasen des zweiten Tages bei 33°C RT zeigten signifikante Erhöhungen der KT um 0,95 1,4°C im Vergleich zu entsprechenden Perioden bei 23°C RT, bei gedämpfter circadianer Rhythmik der KT. Unzureichende Kompensationsversuche spiegelten sich in einer gesteigerten lokomotorischen Aktivität offensichtlich im direkten Zusammenhang mit vermehrter Trinkwasseraufnahme vorm allem der Tagphasen wider. In allen drei Komponenten des MnPO (vor allem des aMnPO) sowie der dorsal cap des OVLT ergab sich eine ausgeprägte Aktivierung von Neuronen, von denen lediglich einige im aMnPO nNOS exprimierten. Die Verteilungsmuster in den Substrukturen des MnPO ähnelten denen bei milder Wärmeexposition. § Der bei der Versuchgruppe C durch i.p. Applikation von hyperonkotischem PEG hervorgerufene, markante Anstieg des Hkt-Wertes bei unveränderten Werten für Plasmaosmolalität und Na+-Konzentration repräsentierte einen reinen Volumenstimulus in Form einer isotonen, intravasalen Hypovolämie, bei unveränderten Daten für KT und lokomotorische Aktivität. Für alle drei Substrukturen des MnPO sowie das zentrale OVLT konnte eine markante neuronale Aktivierung nachgewiesen werden, die jedoch schwächer als bei thermischer Stimulation ausfiel. Dabei konnten für den aMnPO sowie vMnPO Zellen mit nukleärer Fos-Translokation vor allem in deren ventralen Bereichen lokalisiert werden. Im Mittel 6 12 % aller aktivierten Neurone des aMnPO, dMnPO und vMnPO sowie 50 % des OVLT erwiesen sich als nitrerg, bzw. 6 11 % (MnPO) und 30 % (OVLT) aller nitrergen Zellen wurden durch Hypovo-lämie aktiviert. Calcium imaging Versuche in der MnPO-Primärkultur ergaben, dass 26 % respektive 68 % aller getesteten MnPO-Neurone respektive -Astrozyten auf Superfusion mit NA als wichtigstem, einen systemischen Volumenstimulus repräsentierenden Neurotransmitter mit einer transienten Erhöhung der [Ca2+]iz reagierten. Insgesamt 11 % der aktivierten MnPO-Neurone exprimierten nNOS, in Übereinstimmung mit den in vivo ermittelten Daten. Die pharmakologische Charakterisierung des beteiligten Rezeptorsub-typs konnte die funktionelle und immunhistochemische Expression MnPO-intrinsischer α1-Adrenozeptoren demonstrieren. § Der 24-stündige Entzug des Trinkwassers bei 23°C RT (Versuchsgruppe D) bewirkte einen deutlichen Anstieg der Plasmaosmolalität und -Na+-Konzentra-tion, bei marginaler Erhöhung des Hkt-Wertes, und stellte somit einen Stimulus primär des osmoregulatorischen Regelkreises mit partieller Co-Aktivierung der Volumenregulation dar. Bei unveränderter circadianer Rhythmik der KT und der lokomotorischen Aktivität im Verlauf des Dehydratationsversuchs konnten absolute Temperatur- und Aktivitätswerte nahezu identisch mit denjenigen während der Kontrollperioden mit freiem Zugang zu Trinkwasser er-mittelt werden. Für alle drei Komponenten des MnPO sowie beide Substrukturen des OVLT ließ sich eine markante neuronale Aktivierung anhand der nukleären Fos-Translokation nachweisen, wobei sich für die Einheiten des MnPO jeweils das Muster einer ubiquitären, zentralisiert homogenen Fos-Markierung ergab. Im Mittel 17 26 % aller aktivierten Nervenzellen von aMnPO, dMnPO und vMnPO sowie 24 % des OVLT exprimierten nNOS, bzw. 12 - 26 % (MnPO) und 15 % (OVLT) aller nitrergen Zellen wurden durch extrazelluläre Dehydratation der Versuchstiere stimuliert. Durch neuronal retrograde Tracingstudien konnte gezeigt werden, dass etwa 60 respektive 20 % der durch osmotische Stimulation aktivierten nitrergen Neurone des vMnPO respektive aMnPO/dMnPO efferent zum pPVN projizierten. Bei den in vitro Untersuchungen zur induzierten intrazellulären Signaltransduktion konnte AngII als wichtiger, einen systemischen osmotischen Stimulus repräsentie-render Neuromodulator in 4 % der MnPO-Neurone eine Erhöhung der [Ca2+]iz induzieren, wobei die aktivierten Neurone zu 100 % nNOS exprimierten. Nitrergen Neuronen des vMnPO mit efferenter Verbindung zum pPVN scheint somit eine wichtige Funktion im Rahmen der hypothalamischen Regulation der EZF zu übernehmen. In mammals, for instance rats, the nucleus medianus praeopticus (MnPO), located within the blood-brain-barrier, and the organum subfornicale (SFO) respectively the organum vasculosum laminae terminalis (OVLT), located outside the blood-brain-barrier, play important parts as sensorial and sensorial/integrative units considering the central-nervous monitoring of salt-, water- and heat balance. On the one hand the neurons and glia cells of the SFO/OVLT are accessible for ions and hormones, which circulate in the blood, on the other hand both units, especially the MnPO, are integrative elements of the hypothalamus and have a distinct, reciprocal-neuronal connection to the hypothalamus, the limbic system and multiple centre zones of the medulla oblongata. Neurons of the MnPO receive in addition to osmoregulatory afferences of the SFO/OVLT, thermoregulatory afferences of the preoptic hypothalamic region, important information from the periphery after they were preprocessed in the centre regions of the medulla oblongata and pons. The intention of this study was to analyze the relevance of the MnPO, respectively its cells, in the perception of its afferent signals by means of physiological, immunhistochemical and cellbiological techniques. For this reason male Wistar rats were exposed to following test conditions: · Group K: control group (23°C RT; free access to water) · Group A: thermal stimulation (48 h at 30°C RT; free access to water) · Group B: thermal stimulation (48 h at 33°C RT; free access to water) · Group C: volume stimulation (PEG-treatment; no access to water) · Group D: osmotic stimulation (23°C RT; 24 h dehydration) It was measured which effects these test conditions had on body-temperature, locomotive activity, water intake and blood parameters, as a measurement of changes in the extracellular fluid balance. After the test phase the brain was fixed transcardially and coronal brain sections were made to confirm the existence of the transcription factor Fos within the cells of MnPO as well as OVLT. This shows their activity. The activation of specific neuron populations through hypovolemia and increasing temperature leads to the question of the neurotransmitter systems which are involved. In this context the volatile second messenger nitric oxide (NO), which is generated by the enzyme neuronal nitric-oxide-synthase (nNOS), is mentioned by many authors who give it an important role in the perception and integration of thermal-, osmo-, and volume regulatory signals. The confirmation of nNOS occurred immunhistochemically with emphasis on the cellular co-localization to Fos. To show the efferent pathways of activated MnPO neurons to the parvocellular nucleus paraventricularis (pPVN), which is the most important, integrative centre of the hypothalamus, the neuronal tracer true blue was applied to the pPVN, but only in group D. By means of in vivo experimental models, this study tested if the released NO in the MnPO has a neuro-regulatory function regarding the homeostasis of water-, electrolyte- and heat balance. Osmotic signals which are transmitted by means of SFO and/or OVLT, use the octapeptide Angiotensin as the most important neuromodulator. However changes in the extracellular fluid volume are detected through peripheral sensors in the area of the low pressure system and are transmitted by structures of the medulla oblongata, mainly MnPO. Here noradrenalin (NA), as final second-messenger, is mainly responsible for the transmission of the medullar signals to the MnPO. To determine the activation of MnPO intrinsic cells due to hypovolemic stimulation and the downstream intracellular signal transduction, a primary culture of MnPO specific neurons and glia cells were established from neonatal rat brains. In in-vitro experiments the excitation dependent transient elevation of the intracellular calcium-concentration could be detected through superfusion of Fura-2 AM loaded cells of the primary culture and it could be related to specific cells by means of immunhistochemical characterization. Superfused Ang II respectively NA represented the stimulation of MnPO intrinsic cells via extracellular hyperosmolality respectively hypovolemia. Referring to the four experimental conditions (A-D) following results were found: · The mild heat exposure in group A represents a pure thermal stimulation, since there were no changes in plasmaosmolality and sodium concentration and just a minor reduction in plasma volume. During the second night phase at 30° C RT a significant increase of body temperature (0,3-0,4° C) and water intake could be seen compared to the group at 23°C RT. No significant increase could be seen in locomotive activity. In all three substructures of the MnPO and exclusive for the dorsal cap of OVLT a pronounced activation of the neurons could be detected. Only some of these in the ventral zone MnPO could be proved as nitrerg. Within the MnPO especially non-nitrerg neurons in the lateral outer zone showed Fos-translocation within the nucleus, whereas within the vMnPO the Fos-translocation was especially detectable in the non-nitrerg neurons nearest the ventricle. · The higher heat exposure in group B represents a combined thermal, hyperosmotic and hypovolemic stimulation, due to the increased data in HKT, osmolality and sodium concentration of the plasma. Both night phases as well as both day phases on day 2 at 33°C RT showed significant elevations in body temperature (0,95-1,4°C higher compared to 23°C RT) alleviated circadian rhythm of body temperature. Insufficient trials of compensation could be seen in increased locomotive activity combined by an increase in water intake, especially during daytime. All three components of the MnPO (especially the aMnPO) and the dorsal cap of the OVLT showed a distinct activation of neurons. Only few in aMnPO expressed nNOS. The patterns in the substructures were similar to those at mild heat exposure. · The i.p application of PEG in group C resulted in a distinct increase in Hkt with stable plasmaosmolality and sodium concentration, which is why this represents pure volume stimulation in terms of an intravascular hypovolemia with unaltered data in body temperature and locomotive activity. In all three substructures of the MnPO plus the central OVLT a distinct increase in neuron activity could be detected, whereas the activity was less than with pure thermal stimulation. 6-12% of the activated neurons in the aMnPO, dMnPO and vMnPO as well as 50% in the OVLT were nitrerg. Respectively 6-11% (MnPO) and 30% (OVLT) of all nitrerg cells were activated by hypovolemia. A calcium imaging test with the MnPO primary culture showed 26% respectively 68% of all tested MnPO neurons reacted to superfused NA with transient increase in sodium concentration. In accordance to the in vivo determined data 11% of the activated MnPO neurons expressed nNOS. The pharmacological characterization of the involved receptors could demonstrate the functional and immunhistochemical concept of MnPO intrinsic α1- adrenic receptor. · The 24h water withdrawal in group D (23°C RT) caused a distinct increase in plasmaosmolality and sodium concentration with a slight elevation of HKT. Therefore it is primarily an osmoregulatory stimulus with partial co-activation by a volume stimulus. The circadian rhythm of body temperature and the locomotive activity during the water withdrawal were unaltered and the absolute body temperature and locomotive activity were similar to those of the control group. In all three components of the MnPO as well as both components of the OVLT distinct neuronal activity was determined through Fos translocation within the nucleus, whereas the components of the MnPO showed a pattern of ubiquist, centralized homogeneous FOS markings. 17-26% of all activated neurons in the aMnPO, dMnPO and vMnPO as 24% of the neurons of the OVLT expressed nNOS. 12-26% (MnPO) and 15 % (OVLT) of al nitrerg cells were stimulated by dehydration. Neuronal, retrograde tracing studies determined 60% respectively 20% of the nitrerg neurons in the vMnPO respectively the aMnPO/dMnPO, which were activated by osmotic stimulation lead to the pPVN. In vitro research into induced, intracellular signal transduction showed AngII, representing a systemic osmotic stimulation, which as an important neuromodulator induced an increase of calcium concentration in 4% of MnPO neurons. The activated neurons expressed to 100% NOS. Nitrerg neurons in the MnPO with efferent pathways top PVN seam to play an important role in hypothalamic regulation of the extracellular fluid balance.