Untersuchungen zur Bildung, Regression und Funktionalität des Corpus luteum der nicht graviden Hündin : morphologische und biochemische Aspekte

Abstract

Vorliegenden Untersuchungen lag die Frage zu Grunde, inwieweit die bei der nicht graviden Hündin unabhängig von einem uterinen Luteolysin verlaufende Rückbildung der CL durch elektronenmikroskopisch feststellbare Veränderungen charakterisiert wird, inwieweit dabei apoptotische Signale erkennbar sind und ob in einem in vitro System durch Blockierung der Progesteron- und Östrogenrezeptoren auf eine parakrine/autokrine Wirkung von Progesteron und Estradiol geschlossen werden kann. Für die transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden von 19 Beagle-Hündinnen an den Tagen 5, 15, 30, 45, 60, 75 und 113 post ovulationem (p. o.) die Ovarien mittels Ovariohysterektomie (OHE) entnommen, die CL frei präpariert und anschließend für die Dünnschnitt-Technik weiterbehandelt. Entsprechend der festgestellten morphologischen Veränderungen kann bei der nicht graviden Hündin im Verlauf des Diöstrus das Erscheinungsbild des CL den Phasen Proliferation und Regression zugeordnet werden. Charakteristisch für die sich bis Tag 45 erstreckende Proliferationsphase sind rundliche Kerne mit homogener euchromatinischer Struktur und 1-2 Nukleoli, zahlreichen Mitochondrien vom Tubulustyp und das sehr voluminöse glatte ER. Die Zellzwischenräume zeigen neben freien Erythrozyten zahlreiche gut ausgebildete Kapillaren, wobei offensichtlich fast jede Luteinzelle einen engen, direkten Kontakt mit den Kapillaren aufweist. Ab Tag 45 zeigt das glatte ER erste degenerative Veränderungen, wie Verhellungen und Verschmelzungsherde, sowie Lipidvakuolen im Zentrum der wirbelartigen Komplexe (fettige Degeneration). Am Tag 60 zeigen die Zellkerne beginnende Chromatinkondensation (Heterochromatin) oder sind sogar pyknotisch und haben oft gelappte Form. Vom 75. bis zum 113. Tag werden in den Luteinzellen alle Degenerationserscheinungen im Bereich Kern (Lobulierung, Pyknose) und glattes ER (vakuolige Einschmelzungsherde)immer ausgeprägter. Der Nukleus ist nun deutlich lobuliert mit großem Gehalt von Heterochromatin. Das glatte ER ist nach wie vor in Wirbeln mit großen Lipidgranula in deren Zentren strukturiert. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den wenigen bisher zur Morphologie des CL der Hündin beschriebenen Befunden; allerdings ergeben die eigenen Untersuchungen keinen Hinweis auf die Möglichkeit einer Differenzierung zwischen großen und kleinen Luteinzellen (Granulosa- und Theka-Luteinzellen). Sie haben weiterhin gezeigt, dass die morphologisch feststellbare Luteolyse der funktionalen gemessen an der Progesteronsekretion nachhinkt. Auf das Vorkommen der Apoptose wurden CL untersucht, die zu den Tagen 5, 15, 25, 35, 45 und zwischen Tagen 60-80 p. o. mittels OHE von 20 Hündinnen unterschiedlicher Rassen gewonnen und in Paraffin eingebettet worden waren. Die immunhistochemische Detektion erfolgte mittels der Caspase-3- sowie der TUNEL-Methode. Dabei konnten Apoptotische Signale nur an den Tagen 60-80 p. o., also deutlich später als der Beginn der lutealen Regression, nachgewiesen werden. Beim Versuch der Etablierung eines in vitro Zellkultursystems mit Luteinzellen zeigte sich, dass sich brauchbare Kulturen nur mit CL ergaben, die am Tag 5 und gegebenenfalls auch noch an Tag 10 p. o. gewonnen worden waren. Ein Effekt der Hemmung der Progesteronrezeptoren durch das Antigestagen zeigte sich nicht, ebenso wenig wie ein Effekt nach Hemmung der Östrogenrezeptoren durch Tamoxifen. Die Aussagekraft dieser Befunde ist jedoch limitiert, da das CL der Hündin im Verlauf des Diöstrus unterschiedlichen Regelmechanismen unterliegt und da auch nach Cholesterinzusatz keine signifikante Steigerung der Progesteronsynthese beobachtet werden konnte. Investigations of the formation, regression and functionality of the corpus luteum in the non pregnant bitch; morphological and biochemical aspects With the present investigations it was attempted to answer the question how luteolysis in the non pregnant bitch which is independent of a uterine luteolysin is manifested by morphological changes as observed by transelectron microscopy. A further question addressed the appearance of apoptotic signals during luteal regression and the role of progesterone and estradiol 17β as paracrine/autocrine factors as experienced by the blocking of progesterone and estrogen receptors in an in vito system. 19 Beagle bitches were ovario-hysterectomized on days 5, 15, 30, 45, 60, 75 and 113 after ovulation (p.o.), the CL were dissected free and treated for ultrastructural investigation. According to the observed morphological changes the CL of the non pregnant bitch during diestrous shows the phases of proliferation and regression. The proliferative phase, which lasted until day 45, is characterized by round nuclei with a homogeneous, euchromatic structure and one to two nucleoli, a multitude of mitochondria of the tubulus type and a highly voluminous smooth endoplasmic reticulum. Apart from a few erythrocytes the inter-cellular space is penetrated by many well developed capillaries, which apparently each luteol cell having a tight contact with one capillary. First degenerative changes of the smooth endoplasmic reticulum can be observed after day 45; they are characterized by changes in density, fusion loci and lipid-vacuoles in the center of whirl like complexes (fatty degeneration). Intercellular distance between luteal cells and the number of capillaries decreases, collagen fibres start to appear in the stroma. Beginning with day 60 nuclei show an onset of chromatine condensation (formation of heterochromatine), they become pycnotic and are of lobular structure. These signs of degeneration increase between day 57 and 113 p. o., the nuclei are of distinct lobular form with a high content of heterochromatine. The smooth endoplasmic reticulum is still characterized by whirl like structures with large centrally located lipid granula. These results are an agreement with few data published so far on the morphology of the CL of the bitch. However, other than reported, our own investigations did not allow distinction between large and small luteal cells (granulosa and theka-luteincells); our results further indicate that morphological regression is second to functional regression. To test for apoptotic signals CL were obtained via ovariohysterectomy from a total of 20 bitches on days 5, 15, 20, 25, 35, 45 and between days 60 and 80 after ovulation. Apoptotic signals were assed by immunohistochemistry applying the methods of caspases 3 and TUNEL. The detection of apoptotic signals was restricted to days 60 and 80 after ovulation, that is distinctly later than the onset of luteal regression. When trying to establish an in vitro system for canine luteal cells, it had to be experienced that development of useful cultures was restricted to CL from day 5 and also day 10 after ovulation. When using a day 5 culture system neither the blocking of progesterone or estrogen receptors by mifepristone or tamoxifen, respectively, showed any effects. This observation, however, has to be interpreted very carefully as the CL of the dog is subdue to changing regulatory mechanisms during diestrous and also because addition of cholesterol had no significant effect on progesterone synthesis.