Charakterisierung der Tollwutvakzinen "Rabipur" und "Rabivac" und der enthaltenen Virusstämme FluryLEP und PM 1503

Abstract

Tollwut ist eine zoonotische Viruserkrankung, die in ungeimpften Wirten fast immer tödlich verläuft. Zurzeit zugelassene Impfstoffe zur Anwendung beim Menschen basieren überwiegend auf gereinigten inaktivierten Virionen, die über Zellkulturen gewonnen wurden. Diese Vakzinen gelten als sicher und wirksam, allerdings treten nach Immunisierung in einigen Fällen Nebenwirkungen auf.In der vorliegenden Arbeit wurden zwei für die Tollwutprophylaxe des Menschen zugelassene Impfstoffe, "Rabipur" und "Rabivac", charakterisiert. Während die Vakzine "Rabipur" den Tollwutvirusstamm FluryLEP beinhaltet, basiert die Vakzine "Rabivac" auf dem Stamm PM 1503. Analysen der genetischen Heterogenität der genannten Virusstämme im Vergleich mit anderen Impfstämmen zeigten Homologien auf Basis der Nukleinsäuren zwischen 90,23 % und 99,47 %. Die wichtigsten viralen Proteine, die Schutz von einer Erkrankung an Tollwut induzieren, sind das Nukleoprotein und das Glykoprotein. Die Analysen der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten mit jeweils fast 100 % eine hohe Homologie des Nukleoproteins beider Stämme zu anderen Impfstämmen und damit eine Sequenzkonservierung der Antigenregionen. Im Gegensatz dazu wurden nach Vergleich der Glykoproteinsequenzen mehrere Aminosäurenaustausche in Antigenregionen sowie Variationen in Anzahl und Lokalisierung potenzieller N-Glykosylierungsstellen gefunden. Diese Veränderungen können Unterschiede zwischen den Tollwutvirusstämmen im Hinblick auf ihre immunologische Kreuzreaktivität einschließlich Kreuzneutralisation erklären.Zur biochemischen Charakterisierung wurden das Nukleo- und das Glykoprotein der Virusstämme FluryLEP und PM 1503 im Baculovirus-System exprimiert und nach Reinigung zur Gewinnung polyklonaler Seren verwendet. Nach Charakterisierung der Seren mittels Immunoblot, Immunfluoreszenz und Neutralisationstest wurden diese für die Etablierung von Sandwich ELISAs zur Quantifizierung des Nukleoproteins (N-ELISA) und des Glykoproteins (G-ELISA) verwendet. Die Integrität der Viruspartikel, eine entscheidende Determinante für die Potenz von Impfstoffpräparationen, wurde direkt in der Immunelektronenmikroskopie sowie indirekt mit Hilfe der etablierten ELISA-Verfahren untersucht. Das Nukleoprotein ist im Inneren von Virionen lokalisiert und somit bei intakten Partikeln für Antikörper nicht zugänglich. Durch Freisetzung des Nukleoproteins und weitere Analysen der Proben im ELISA konnte gezeigt werden, dass ungefähr 90 % dieses viralen Proteins nicht zugänglich für Antikörper war und somit wahrscheinlich als Teil von Viruspartikeln vorlag. Elektronenmikroskopisch ließen sich intakte und defekte Virionen nachweisen. Somit liefern diese Ergebnisse eine Erklärung für den Nachweis von Tollwutvirusnukleoprotein mittels des N-ELISAs in nativen Impfstoffpräparationen. Weiterhin wurde die Proteome der Impfstoffpräparationen charakterisiert. Virale und nicht virale Proteine ließen sich mit Hilfe verschiedener Verfahren wie Immunoblot, N-terminale Peptid-Sequenzierung sowie MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation time-of-flight Mass Spectrometry) identifizieren. Die viralen Nukleo-, Glyko-, Matrix-, Phospho- und Largeproteine wurden in dem Impfstoff "Rabipur" und, mit Ausnahme des Phosphoproteins, auch in dem Impfstoff "Rabivac" nachgewiesen. Zusätzlich konnten sechs nicht virale Proteine als Bestandteile der Impfstoffe identifiziert werden. Die Serumproteine Albumin und Haptoglobin wurden als Hauptverunreinigungen in beiden Vakzinen gefunden. In dem Impfstoff "Rabipur" wurden zusätzlich Hemopexin, Actin, Alpha-1b-Glykoprotein und Afamin nachgewiesen.Die hier vorgestellten Ergebnisse beinhalten eine umfassende Charakterisierung von zwei Tollwutimpfstoffen auf morphologischem, molekularem und biochemischem Niveau. Hieraus lassen sich Möglichkeiten zur Optimierung der Qualitätskontrolle ableiten; die Analysen legen nahe, dass die Integrität von Viruspartikeln in Tollwut-Impfstoffpräparationen beurteilt werden sollte. Rabies is a viral zoonotic disease with almost invariably fatal outcome in unvaccinated hosts. Currently licensed vaccines for human use are generally based on purified inactivated virus grown in cell culture. These vaccines are regarded as safe and efficacious; however, after vaccination side effects occur in some cases.In the present study two licensed vaccines for the prevention of human rabies, namely Rabipur and Rabivac , were characterised. The vaccine Rabipur is based on rabies virus strain FluryLEP while the vaccine Rabivac contains virus strain PM 1503. Analyses of genetic heterogeneity of these virus strains in comparison with other vaccine strains revealed homologies between 90,23 % and 99,47 % at the nucleotide level. The most important viral proteins involved in protection against rabies are the glycoprotein and the nucleoprotein. Amino acid sequence comparison of FluryLEP and PM 1503 nucleoprotein with other vaccine strains showed high homology with nearly 100 % sequence conservation within the known antigenic regions. In contrast, sequences of the glycoprotein showed some amino acid exchanges and variation in the number and position of potential N-glycosylation sites. Such differences may explain the variability in cross-reactivity and cross-neutralisation between virus strains.In order to characterise the vaccines at the biochemical level, the nucleoprotein and the glycoprotein of FluryLEP and PM 1503 strains were expressed via the baculovirus system and used after purification to generate polyclonal sera. After characterization by immunoblot, immunofluorescence and virus neutralisation, polyclonal sera were used to establish sandwich ELISAs for the quantification of the viral nucleoprotein (N-ELISA) and the viral glycoprotein (G-ELISA). The integrity of viral particles, a crucial determinant for the potency of vaccine preparations, was directly examined by immunoelectron microscopy and indirectly by using the established ELISAs. The nucleoprotein is localized within virions and therefore not accessible to antibodies in intact particles. After the release of the nucleoprotein and further analysis of the samples using ELISA, it could be demonstrated that approximately 90 % of this viral protein was not accessible to antibodies and thus probably part of virus particles. Negative staining revealed the presence of intact and damaged particles. Accordingly, these results provide an explanation of the detection of viral nucleoprotein in native vaccine preparations using the N-ELISA. Furthermore, the proteome of the vaccine preparations was characterized. Viral and non viral proteins were identified using different methods such as immunoblot, N-terminal amino acid sequencing and MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry). The viral nucleoprotein, glycoprotein, phosphoprotein, matrix and large protein were identified in the vaccine Rabipur and, with the exception of the phosphoprotein, in the vaccine Rabivac . In addition, six non viral proteins could be identified as components of the vaccines. The serum proteins albumin and haptoglobin were recognized as the major contaminants in the vaccine preparations. The vaccine Rabipur contained also hemopexin, actin, alpha-1b-glycoprotein and afamin.The results of the presented study reveal detailed information about two rabies vaccines for humans at the morphological, molecular and biochemical level. The results imply ways for improvement of vaccine quality control; the analyses suggest that the integrity of viral particles in vaccine preparations against rabies should be assessed.