Identifizierung und Charakterisierung der Phosphodiesterasen-Isoenzyme in Bronchialepithelzellen

Abstract

Asthma bronchiale ist mit einer Prävalenz von 10 % bei Kindern und 5 % bei Erwachsenen eine der häufigsten chronisch pulmonalen Erkrankungen. SeitJahrzehnten haben die Methylxanthine mit ihrem wichtigsten Vertreter Theophyllin in seiner Therapie einen bedeutenden Stellenwert. Als entscheidenderWirkmechanismus dieser Medikamente wurde die Hemmung der Phosphodiesterasen (PDE) erkannt. Eine Vielzahl von Untersuchungen belegt, daß dieverschiedenen PDE-Isoenzyme in den einzelnen Gewebe- und Zelltypen höchst differenziert verteilt auftreten. Aufgrund der leider nur unspezifischen Inhibitionder Phosphodiesterasen durch Theophyllin vereint es die bronchodilativen und entzündungs-hemmenden Eigenschaften mit einer Reihe starker, seineAnwendung limitierende Nebenwirkungen. Vor diesem klinischen Hintergrund ist das große Interesse an Phosphodiesterasen verständlich. Das Substrat der PDE sind die zyklischen Nukleotide. Siespielen eine zentrale Rolle als 'second messenger' in intrazellulären Signaltransduktionswegen. Zusätzlich mehren sich die Hinweise auf eine funktionelleBedeutung von cAMP und cGMP auch im extrazellulären Kompartiment.Die vorliegende Arbeit fokussierte auf die Untersuchung von primär isolierten Bronchialepithelzellen des Menschen (hAEC), des Schweines (pAEC) und derhumanen, bronchialen Epithelzellinie BEAS-2B. Ziel war die Identifizierung der Isoenzymfamilien, die in den genannten Zelltypen den Abbau der zyklischenNukleotide leisten. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden selektive Inhibitoren der PDE-Familien in zwei sich ergänzenden methodischen Ansätzenverwendet. Mit einem Radio Immuno Assay (RIA) konnte in intakten Zellen nach Stimulation der Adenylat- bzw. der Guanylatzyklase und Inkubation mitverschiedenen PDE-Hemmern die Konzentrationsänderungen des endogenen cAMP und cGMP gemessen werden. Darüberhinaus wurde in Zellysaten nachZugabe einer definierten Menge an exogenen zyklischen Nukleotiden die vorhandene Enzymaktivität in Gegenwart von Inhibitoren im PDE-Assay direktbestimmt. Die Analyse der Ergebnisse beider Methoden ergab folgendes Bild: cAMP wurde überwiegend durch PDE4 und cGMP zum größten Teil durch PDE5hydrolysiert. In hAEC konnte zusätzlich der Ca2+/CaM-abhängigen PDE1 ein Anteil von durchschnittlich 20 % am Abbau von cGMP zugeordnet werden. Inallen drei Zelltypen wies eine Rolipram-insensitive Eliminierung von cAMP auf das Vorhandensein einer PDE7 hin. Der extrazelluläre Anteil von cAMP lag beica. 30 % und von cGMP bei ca. 60 % der jeweiligen Gesamtmenge an zyklischen Nukleotiden.In weiteren Studien, die nicht Bestandteil dieser Promotionsarbeit sind, kamen molekular-biologische Methoden zum Einsatz. Dadurch konnten zu den inBronchialepithelzellen als funktionell bedeutsam identifizierten PDE-Familien die jeweils vorhandenen Gene und die gebildeten mRNA-Splice-Variantenidentifiziert werden. Erst die Kombination von bio-chemischen und molekularbiologischen Ergebnissen erlaubt letztlich eine differenzierte Aussage über dasexakte Isoenzymmuster einer Zelle. Klinischer Ausgangspunkt der Überlegungen war die Notwendigkeit zur Entwicklung einer effektiveren Therapie von entzündlichen, obstruktivenAtemwegserkrankungen. Die Hemmung der Phosphodiesterasen hat sich prinzipiell bereits als ein gangbarer Weg erwiesen. Um eine gezielte und damitnebenwirkungsarme Medikation zu ermöglichen, ist die Erstellung von differenzierten PDE-Profilen für alle in dieses Krankheitsbild involvierten Zellen eineGrundvoraussetzung. In diese Zusammenhang stellt die Untersuchung des Bronchialepithels also einen kleinen, aber notwendigen Schritt zu intelligenterenTherapiestrategien dar. Aufgrund der großen Bedeutung der zyklischen Nukleotide für eine Vielzahl von Regulations-vorgängen scheint die Beeinflussung der Aktivität derPhosphodiesterasen noch weitere erfolgversprechende Behandlungskonzepte zu ermöglichen. Neben Asthma bronchiale liegen konkrete klinische Erfahrungenu. a. bei Mukoviszidose, pulmonaler Hypertonie, Lungenödem bei ARDS-Patienten, schwerer Herzinsuffizienz und erektiler Dysfunktion vor.