Telomeraseaktivität als neuer Prognoseparameter bei Neuroblastomen im Säuglingsalter

Abstract

Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor im Kindesalter außerhalb des ZNS. Diese Erkrankung ist besonders kompliziert durchihren schwer vorhersehbaren Verlauf und die deutlich unterschiedliche Prognose in den einzelnen Stadien. So kann er sich in einemStadium trotz ausgeprägter Metastasierung plötzlich spontan zurückbilden oder zu einem benignen Geschwulst ausreifen. In lokalisierten,zunächst als günstig eingeschätzten Stadien hingegen, muß man ein schnelles, nicht aufzuhaltendes Wachstum feststellen. Diese Tatsachewirft für das Neuroblastom immer wieder die Frage nach neuen Markern auf, die einen Hinweis auf den weiteren Verlauf der Erkrankunggeben können. Dieses erhofft man sich von der Telomerase. Hierbei handelt es sich um ein Enzym, das der Zelle dazu verhilft, ihreeingeschränkte Teilungsfähigkeit zu überwinden und eine unendlich große Wachstumspotenz zu erreichen. In vielen anderen Tumorenwurde sie in bis zu 99% der Fälle nachgewiesen, wo sie eindeutig mit einer schlechten Prognose korreliert. Wir untersuchten daher die Bedeutung der Telomeraseaktivität in Neuroblastomen für deren Prognose. Hierfür wurden 109 Neuroblastome verschiedener Stadien mittels des Telomerase-PCR-ELISA untersucht. Die Tumorproben entstammender Tumorbank des Neuroblastomlabors, unter der Leitung von PD Dr. H. Christiansen. Für die Aktivitätsmessung verwendeten wir das Kit für Telomerase PCR ELISA der Firma Boehringer Mannheim. Es wurden kleinsteTeile der Tumoren lysiert und nach dem telomeric repeat aplification protocol weiterbearbeitet. Das Protokoll beruht auf dem Prinzip,Produkte der Telomerase nachzuweisen. Hierfür macht man sich ihre Funktion zu Nutze, telomerische DNA an einen Primer zu hängen, dieanschließend mittels der PCR amplifiziert wird. Liegt in der Probe keine Telomerase vor, wird keine DNA synthetisiert und somit auch nichtamplifiziert. In einem weiteren Arbeitsschritt kann eine Amplifikation durch Antikörpermarkierung der telomer-spezifischen Sequenz undnachfolgender Farbreaktion im ELISA nachgewiesen werden. In 28 der 109 untersuchten Neuroblastome konnte eindeutig Telomeraseaktivität nachgewiesen werden, während hingegen 68 derTumoren als telomerasenegativ und 13 als grenzwertig eingestuft wurden. Eine Aktivität in über 90% der Tumoren wie in den meistenanderen Versuchsreihen konnte nicht gefunden werden. Der Nachweis von Telomeraseaktivität in einem Neuroblastom, ungeachtet der Stadien-oder Altersverteilung, korreliert eindeutig mit einerschlechten Prognose des Patienten und hat daher Bedeutung als negativer Prognosefaktor. Die größte prognostische Aussagekraft ergibt sich allerdings für die Gruppe der Säuglinge, die normalerweise aufgrund ihres Alters einerelativ gute Prognose haben, welche sich bei Nachweis von Telomeraseaktivität des Neuroblastoms entscheidend verschlechtert. Wir konnten in unserer Versuchsreihe eine signifikante Korrelation der Telomeraseaktivität mit der Amplifikation des MYCN-Gens belegen.Die jüngsten Daten zeigen hier, daß die mRNA Expression der katalytischen Untereinheit der Telomerase durch das c-MYC-Proteinverstärkt wird und lassen so auch eine Vermutung auf eine solche aktivierende Rolle von MYCN zu. In den Stadien IV und IVs, die gelegentlich klinisch schwer zu unterscheiden sind, könnte Telomeraseaktivität in Zweifelsfällen eineEntscheidungshilfe sein. Hier sind allerdings Studien mit einer höheren Anzahl an IVs Neuroblastomen notwendig. The neuroblastoma is the most common solid malignancy of childhood outside the central nerve system. It is especially complicatedbecause of the differences in its clinical course and the different prognosis for each stage of the disease. Some tumours demonstratespontanous differentiation or regression even if already widely spread following minimal or no therapy while others less advanced areassociated with poor survival in spite of modern therapy. This fact leads to the need for new prognostic markers, who helps distinguishing cases of varying risk and thus allows to choose the besttherapy for each patient. One of these markers might be the enzyme telomerase, that has been object of intense research in the last years,because it allows a cell to overcome immortality, which is an important fact for tumorgenesis. It has been established in up to 99% of thecases in a lot of different tumours, where it showed significant correlation with poor prognosis and tumourprogression. To examine the significance of telomeraseactivity for neuroblastoma, we tested 109 of these tumours in different stages using theTelomerase-PCR-ELISA from boehringer mannheim. Very small parts of these samples, which were sent to the laboratory forneuroblastoma research under the supervision of Doctor Christiansen, were lysated and treated as described by the protocol. This test uses the telomerase activity putting telomeric DNA to a primer, which can be prooved with an ELISA after being amplified by thePCR. Without telomerase in the probe there is no PCR product to be seen in the ELISA. We found that 28 of the 109 neuroblastoma showed telomeraseactivity, whereas 68 of the tumours didn t. 13 had to be classified asborderline probes with no clear classification to one or the other group. An activity in around 90% of the tumours like other studies showedcould not be confirmed. The activity of telomerase in neuroblastoma shows a significant correlation with poor prognosis and therefor could be used as a prognosticmarker. For the group of the children under one year of age, who normally have a very favorable prognosis because of their age, the proof oftelomerase activity gives the most significant information about prognosis of all the patients with such a tumour. The information about telomeraseactivity also could be of value for the patients with a neuroblastoma in a IVs-stage. TheIVs-stage-neuroblastomas normally undergo sudden differentiation or regression and thus have a very good prognosis. Not so if proofen tobe telomerasepositiv. Besides one can get difficulties in distinguishing between a stage IV and IVs just by clinical appearance. In this casetelomerase can give some extra information. Further on we could demonstrate a significant correlation between the amplification of the MYCN-gen and telomerase activity. The lateststudies show that the expression of the m-RNA of the telomerase catalytic subunit is increased by the protein of the c-Myc-gen. One couldpresume a similar role for the MYCN-gen.