Einfluss von Metaboliten aus dem Sekundärstoffwechsel von Malassezia furfur auf humane kultivierte Melanozyten

Abstract

Pityriasis versicolor ist eine durch Hefepilz Malassezia furfur bedingte Erkrankung der Haut, die vor über 200 Jahren beschrieben wurde.Die typische klinische Ausprägung dieser Krankheit besteht in der Ausbildung von bräunlichen Maculae und zugleich Depigmentierungen auf der Haut.Ein erklärendes Modell des Pathomechanismus wurde jedoch nicht gefunden.In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Tryptophan-Metaboliten aus Malassezia furfur auf kultivierte humane Melanozyten untersucht. Darüber hinaus wurde versucht, die gefundene Wirkung mit den klinischen Erscheinungen der Pityriasis versicolor in Beziehung zu setzen. Zunächst wurde ein Rohextrakt aus der Kulturen der Hefe isoliert, die Tryptophan als einzige Stickstoffquelle erhielten, und ins Zellkulturmedium zugegeben. Innerhalb von ersten Stunden nach der Zugabe konnten lichtmikroskopisch erhebliche morphologische Veränderungen beobachtet werden: statt des dendritischen Aufbaues fanden sich bipolare Zellen, in den höchsten Konzentrationen auch völlig abgerundete Zellen. Der Rohextrakt wurde dann solange mittels präparativer DC und präparativer HPLC gereinigt, bis eine einzige Verbindung isoliert werden konnte. Die in Gießen erhaltenen Proben wurden in München mittels 1H- und 13C-NMR (600MHz), Massenspektroskopie (HRMS) sowie FT-IR-Spektroskopie analysiert. Die Substanz erwies sich als das schon bekannte, aus Malassezia-Kulturen isolierte Malassezin. Es wurde die Konzentrationsabhängigkeit der Veränderungen durch Malassezin in der Melanozytenkultur charakterisiert. Dabei wurden die Zellen auf Vitalität, Proliferation und Reversibilität der Veränderungen untersucht. Sowohl die Vitalität (durchgeführt mit Trypan-Blau Färbung) als auch die Proliferation (MTT-Test) wurden konzentrationsabhängig durch Malassezin beeinträchtigt (LD50 ca. 10 µM). Es fand sich ein typisch sigmoider Konzentrationsverlauf, d. h. in niedrigen Konzentrationen waren die Einflüsse eher gering im Vergleich mit den Kontrollzellen. Elektronenmikroskopisch wurden generelle Zeichen der Zellschädigung nachgewiesen. Es wurden auch apoptotische Erscheinungen gefunden wie blebbing an der Zelloberfläche, teilweise Chromatinkondensierung in dem Zellkern. Die Melanosomen waren zwar teils zu erkennen, schienen insgesamt aber seltener vorhanden zu sein. Um die Zellveränderungen zu spezifizieren, wurde zwischen Apoptose und Nekrose mittels FACS differenziert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Annexin-V-Fluos (Roche, Mannheim) angefärbt, die als einer der Apoptose-spezifischen Marker gilt. Zur Abgrenzung der nekrotischen Zellen wurde zusätzlich eine Gegenfärbung mit Propidiumiodid durchgeführt. Es wurde eine dosisabhängige Apoptose detektiert. Die nekrotischen Zellen wurden in den höchsten angesetzten Konzentrationen von Malassezin gefunden. Um die Apoptose weiter zu charakterisieren, wurde der Nachweis einer Aktivierung der Caspasen 8 und 9 durchgeführt. Die Analyse zeigte eine erhebliche und dosisabhängige Aktivierung der Caspase 9. Diese Ergebnisse sprechen für einen internen Apoptoseweg, der durch mitochondriale Dysfunktion entsteht. Apoptose-spezifische Veränderungen des Zellkernes wie sog. apoptotic bodies , die Folge der Abschnürungen der Zellmembran sind, konnten in der sog. Höchst-Färbung beobachtet werden. Bei dem Comet Assay wurden komet-ähnliche Zellen, mit auswanderten DNA-Fragmenten beobachtet, was auch Apoptose-spezifisch ist. Durch die Bestimmung der LDH- Freisetzung konnte eine toxische Wirkung von Malassezin nachgewiesen werden, die mit diesem Parameter schon bei geringen Konzentrationen zu messen war (ED50 ca. 3,4 µM). Die nachgewiesene Toxizität korreliert sehr gut mit der mitochondrialen Dysfunktion, die durch die Caspase-9-Aktivierung belegt wurde. Auch die Untersuchung der Melaninsynthese über den Einbau von 14C -markiertem Tyrosin ergab eine konzentrationsabhängige Inhibition, wobei natürlich diese auch Ausdruck einer allgemeinen Zellschädigung sein kann und keine spezifische Wirkung.Die Anfärbung zytoskelettaler Elemente ergab bei der Aktin-Färbung einen Verlust der Anfärbbarkeit mit zunehmender Konzentration, wobei allerdings dieser Einfluss bereits unterhalb des durch LDH-Freisetzung bestimmten Toxizitätsbereiches erfolgte. Die Anfärbung des melanosomalen Proteins MART-1 zeigte keine Veränderung, was auf eine nicht eingeschränkte Synthese der melanosomalen Strukturen hinweist. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen sollten weitere Einsichten in den Pathomechanismus der Pityriasis versicolor gewinnen. Die Untersuchungen der Einwirkung von Metaboliten der Hefe M. furfur auf kultivierte humane Melanozyten haben als prominentes melanozytotoxisches Prinzip unter der Vielzahl von Verbindungen den bereits bekannten AH-Rezeptoragonisten Malassezin ausgewiesen. Dies untermauert die Hypothese weiter, dass die Veränderungen in vivo durch die Metabolite von Malassezia-Hefen verursacht werden.