Importance of alphavbeta3 integrin in arteriogenesis in the peripheral circulation of the rabbit

Abstract

The objective of the present study was to investigate the possible role of alphavbeta3 integrin and its main ligand vitronectin in the growth of collateral arteries (arteriogenesis). Integrins are membrane receptor proteins that mediate cell-ECM and cell-to-cell interactions. Among other cells, endothelial cells and smooth muscle cells express alphavbeta3 integrin, and it is implicated in biological processes such as angiogenesis, neointima formation, platelet aggregation and macrophage transmigration. Seventeen male, specific-pathogen-free New Zealand White rabbits with an average weight of 2.5 kg were subjected to experimental occlusion of the femoral artery or sham operated. After 1, 3, 7, 14 or 56 days of femoral occlusion, the vastus intermedius of the quadriceps muscle was excised and cryopreserved. Transversal sections were immunostained with antibodies specific either for alphavbeta3 integrin or vitronectin, and the intensity of immunoperoxidase staining signal was quantified by computer software imaging. The proliferation marker Ki-67 was used to identify growing collateral arteries. Quiescent arteries in sham operated and experimental animals showed alphavbeta3 integrin staining just above the level of detection. A significant increase in integrin content was found in the endothelium of growing collateral arteries 3 days after occlusion (3.2 fold, p<0.005), and in the endothelium and media 7 days after occlusion (3.7 fold, p<0.001; 7 fold, p<0.001; respectively). Fourteen days after occlusion, alphavbeta3 integrin protein already returned to initial levels. The increase was restricted to growing collateral vessels. Contrarily, vitronectin content in the endothelium of growing collaterals 7 days after occlusion decreased compared to controls and returned to initial, higher levels after 14 days. These results demonstrate that alphavbeta3 integrin plays a role in the arteriogenic process but that vitronectin is not the main ligand for alphavbeta3 integrin in arteriogenesis. The functions of this integrin in this context are probably related to macrophage recruitment and/or growth factor receptor clustering, both required for proper collateral development during the proliferative phase. It could also play a role in early vasodilation, in formation of a subsequently remodeled neointima, as a mechanosensor in signal transduction, and as an anti-apoptotic signal. The most probable ligand for alphavbeta3 integrin in the process of arteriogenesis as indicated by previous studies is osteopontin, which is also acting in the vascular system. Considering all the potential functions of alphavbeta3 integrin in arteriogenesis and the different known and possibly unknown ligands of this receptor, it is quite evident that further studies are necessary to elucidate the exact role of alphavbeta3 integrin and to determine its ligand or ligands, if any in the process of arteriogenesis. This is particularly interesting in regard to anti-restenotic therapies, which are prescribed, for example after balloon angioplasty, and include non-specific integrin blockers. This may well interfere with arteriogenesis, which can be regarded as the physiological mechanism for limitation of the consequences of arterial stenosis or occlusion. Das Ziel dieser Dissertation war es, die mögliche Bedeutung von alphavbeta3 Integrin und seines Hauptliganden Vitronektin für das Wachstum von Kollateralarterien (Arteriogenese) zu untersuchen. Die sogenannten Integrine sind Glykoprotein-Oberflächenrezeptoren, die Zell-Zell Wechselwirkungen und Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix vermitteln. Das Integrin alphavbeta3 kommt im Gefäßsystem unter anderem auf Endothelzellen und glatten Muskelzellen vor und ist an so wichtigen biologischen Prozessen wie der Angiogenese (Neubildung von Kapillaren), der Neointima-Bildung, der Plättchenaggregation und der Monozytenwanderung beteiligt. Bei 17 männlichen, spezifisch-pathogen-freien Weißen Neuseeländer Kaninchen wurde durch zweifache Ligatur der Arteria femoralis eine chronische, regionale Ischämie des Hinterbeins induziert, beziehungsweise eine Sham-Operation ohne Anziehen der Ligaturen durchgeführt. Nach 1, 3, 7, 14 oder 56 Tagen wurde der Vastus intermedius des Musculus quadriceps entnommen und zur immunhistochemischen Untersuchung kryokonserviert. Transversale Serien-Gefrierschnitte der Proben wurden entweder mit spezifischen Antikörpern für alphavbeta3 Integrin oder für Vitronektin gefärbt. Die Intensität des resultierenden Immunoperoxidase-Signals wurde mit Hilfe von Computer Image Software quantifiziert. Eine immunhistologische Färbung mit dem Proliferationsmarker Ki-67 wurde verwendet, um wachsende Kollateralarterien zu identifizieren. Kollateralen aus Kontrollgewebe (nach Sham-Operation) und nicht-proliferierende Kollateralen aus Gewebe nach Femoralokklusion zeigten ein Signal für alphavbeta3 Integrin nah der Nachweisgrenze. Eine signifikante Steigerung des alphavbeta3 Integrin Gehalts war in wachsenden Kollateralarterien 3 Tage nach Femoralokklusion im Endothel (3,2-fach, p=0,005) und 7 Tage nach Okklusion im Endothel und der Media (3,7-fach, p=0,001 bzw. 7-fach, p=0,001) nachweisbar. Vierzehn Tage nach Femoralokklusion sank der alphavbeta3 Integrin Gehalt in vielen wachsenden Kollateralen bereits auf ursprüngliche Werte zurück. Der beschriebene Anstieg trat nur in wachsenden Kollateralarterien auf. Im Gegensatz dazu sank 7 Tage nach Okklusion die Färbeintensität für Vitronektin im Endothel von wachsenden Kollateralen signifikant ab und ging nach 14 Tagen auf die ursprünglichen, hohen Werte zurück. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, daß alphavbeta3 Integrin eine Rolle in der Arteriogenese spielt, wobei in diesem Prozeß Vitronektin nicht der Hauptligand des Integrins ist.Die Funktionen, die alphavbeta3 Integrin in diesem Fall ausübt, stehen wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Anziehung von Makrophagen und/oder dem Clustering von Wachstumsfaktoren. Beides sind wichtige Faktoren in der proliferativen Phase der Arteriogenese. Weiterhin könnte alphavbeta3 Integrin bei der frühen Vasodilatation, bei der Bildung der später umgebauten Neointima, als Mechanosensor bei der Signalübertragung und als anti-apoptotisches Signal eine Rolle spielen. Mehrere Studien geben Hinweise darauf, daß der wahrscheinlichste Ligand für alphavbeta3 Integrin in der Arteriogenese Osteopontin ist, welches diverse Funktionen im Gefäßsystem unterstützt. In Anbetracht der vielen möglichen Funktionen von alphavbeta3 Integrin in der Arteriogenese und der Vielzahl von bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden dieses Integrins wird klar, daß weitere Studien nötig sind, um die offen gebliebenen Fragen zu klären. Dies ist besonders wichtig im Hinblick auf Anti-Restenose-Therapien, die nach Operationen, wie z.B. Ballonkatheter-Gefäßdilatationen, mit unspezifischen Integrin-Blockern bereits durchgeführt werden. Unter Umständen reduzieren diese Therapieansätze nicht nur die Restenosierung, sondern beeinflussen auch die Arteriogenese, die als natürlicher Mechanismus zur Schadensbegrenzung im Falle von arteriellen Stenosen oder Verschlüssen betrachtet werden kann.