Bestimmung und Bedeutung antiendothelialer Antikörper beim Menschen : Entwicklung verschiedener Testverfahren zur Quantifizierung antiendothelialer Antikörper und Anwendung dieser Tests bei einem Normalkollektiv und bei Patienten

Abstract

Antiendotheliale Antikörper (AECA) wurden erstmals von Lundquist und Osterland im Jahre 1971 im Zusammenhang mit Systemischem Lupus erythematodes nachgewiesen. Seither wurden AECA intensiv mit unterschiedlichen Methoden untersucht. Sie werden heute ursächlich bei verschiedenen vaskulären Autoimmunerkrankungen diskutiert und könnten von diagnostischem Wert sein. Zu Beginn dieser Arbeit sollte ein Testverfahren zum Nachweis von antiendothelialen Antikörpern entwickelt werden. Auf der Basis von humanen umbilikal-venösen Endothelzellen (HUVE-Zellen) und sonifizierten HUVE-Zellen (HUVEC-Lysat) wurden ELISAs zum Nachweis von AECA-IgG und -IgM etabliert. Damit stand eine hoch sensitive Methode zum semi-quantitativen Nachweis dieser Autoantikörper zur Verfügung. Mit diesen Testverfahren folgten Untersuchungen an gesunden Blutspendern und verschiedenen Patientengruppen. Es zeigte sich, dass AECA-Titer unabhängig von Alter und Geschlecht des Blutspenders waren. Es bestand allerdings eine signifikante Korrelation der AECA-Titer mit der Immunglobulin-Gesamtkonzentration einer Antikörperklasse. Deshalb wurden Quotienten der AECA-Titer zur Immunglobulin-Gesamtkonzentration errechnet und die AECA-Konzentration im Plasma als Quotient von AECA-IgG-Titer/IgG-Konzentration bzw. AECA-IgM-Titer/IgM-Konzentration angegeben. Damit wurde eine zuverlässige Auswertung gewährleistet. Es konnte gezeigt werden, dass AECA Bestandteile des natürlichen Antikörperrepertoir der gesunden Bevölkerung sind. Unter den hier untersuchten gesunden Blutspendern fanden sich sechs Individuen mit als pathologisch definierten Werten ohne klinische Beeinträchtigung. Nach Etablierung der Testverfahren und Festlegung der Normalwerte wurden AECA-Konzentrationen bei Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen bestimmt. Die Gruppe der Patienten mit Verdacht auf Vaskulitis (n=37) zeigte in den zellulären AECA-ELISAs signifikante Abweichungen der Mittelwerte von der Referenzgruppe. Hier waren die AECA-IgM-Quotienten prozentual häufiger positiv als AECA-IgG-Quotienten. Die Gruppe der Patienten mit Verdacht auf ein Lupus antikoagulans (n=54) unterschied sich sehr deutlich von der Referenzgruppe. Mit Ausnahme der AECA-IgM-Quotienten auf Lysat-Basis zeigten alle Mittelwerte höchst signifikante Ergebnisse. Bei der Gruppe der Patienten mit nicht näher definierter rheumatischer Grunderkrankung (n=108) zeigten sich keine signifikanten Abweichungen der Mittelwerte der AECA-Quotienten von der Referenzgruppe. Mögliche Gründe hierfür sind eine unzureichende Charakterisierung des Kollektivs, Vorherrschen von AECA-IgA, die hier nicht erfasst wurden, oder künstlich niedrige AECA-Quotienten aufgrund von nicht bekannten therapeutischen Interventionen. In der relativ kleinen Gruppe der Patienten mit systemischem Lupus erythemathodes (n=4) wichen die Mittelwerte der Quotienten der zellulären AECA-ELISAs zwar signifikant von der Referenzgruppe ab, eine Schlußfolgerung kann wegen der geringen Patientenzahl jedoch nicht gezogen werden. Das hier ermittelte vermehrte Vorkommen von AECA bei Vaskulitiden, Lupus antikoagulans und SLE stützt die Theorie, dass Endothelzellen an dem Entzündungsgeschehen dieser Erkrankungen beteiligt sind. Vergleiche von zellulären mit Zell-Lysat-ELISAs sind in der Literatur extrem selten. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Beleg für die Korrelation beider Verfahren erbracht werden. Aufgund der ermittelten Korrelation, der geringeren Anfälligkeit der Antigenkopplung an die feste Phase und der besseren praktischen Durchführbarkeit bietet der Lysat-ELISA eine Alternative für die Routinediagnostik der AECA. Die Anwendung der Test-verfahren an verschiedenen Patientenkollektiven erbachte jedoch häufiger signifikante Ergebnisse auf der Basis zellulärer ELISAs. AECA scheinen eine heterogene Gruppe von Autoantikörpern zu sein. Dies zeigte sich in dieser Arbeit an verschiedenen Stellen. Erstes Indiz liefern die durchweg linkssteilen Verteilungen der AECA-Quotienten in allen untersuchten Gruppen. Die partiellen Korrelationen mit Anticadiolipin-, Antiphospholipid- und Lupus antikoagulans-Antikörpern charakterisieren mögliche AECA-Subpopulationen genauer. Hingegen konnte gezeigt werden, dass AECA nicht identisch sind mit anderen ursächlichen Autoantikörpern in der Pathogenese der Vaskulitiden, den Antikörpern gegen humane neutrophile Granulozyten. Antiendothelial antibodies (AECA) were described for the first time by Lindquist and Osterland in association with Lupus erythematosus in 1971. From that day on AECA were thoroughly investigated with different methods. Today AECA are discussed as cause of vascular autoimmune disorders and can be of diagnostic value. At the beginning of this thesis a method for the detection of AECA had to be developed. Based on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and sonicated HUVE-cells (HUVEC-lysate) an ELISA was established which was able to detect AECA-IgG and -IgM. The assays provide a highly sensitive method for the semi-quantitative detection of these autoantibodies. This tool was used to investigate healthy blood donors as well as patients with different autoimmune diseases. The investigations reveiled that AECA-titers are independent of the donor s age and gender. However, a significant correlation of AECA-titers and total immunoglobulin concentration in each class was determined. Therefore the quotient of AECA-titers and immunglobilin-concentration was built and the plasmaconcentration of AECA was described as AECA-IgG-titer/IgG-concentration or AECA-IgM-titer/IgM-concentration. Thus, a reliable evaluation was achieved. It was shown that AECA are part of the physiological human antibody repertoire. Among the tested healthy blood donors six individuals with AECA-titers defined as pathologic, were detected without clinical relevance. After establishing the assays and defining reference values AECA-concentrations in patients with different diseases were determined. In the cellular assay patients with suspected vasculitis (n=37) showed a significant deviation in mean AECA-quotients compared to the reference group. In this case the percentage of positive AECA-IgM-quotients was higher than of AECA-IgG-quotients. The group of patients suspected to be suffering from Lupus anticoagulans (n=54) differed clearly form the reference group. Except of AECA-IgM-quotients on lysate basis all mean values showed highly significant results. Patients with undefined rheumatic disease (n=108) did not show a significant deviation with regards to the mean AECA-quotient values compared to the reference group. Possible reasons are the missing characterisation of the collective, a predominance of AECA-IgA, which were not included in this investigation, or artificially low AECA-quotients due to unknown therapeutic interventions. In the relatively small group of patients suffering from systemic lupus erythematosus (SLE) the mean AECA-ELISA-quotients in the cellular assays differed significantly from those of the reference group. Nevertheless, conclusions can not be drawn because of the small amount of patients included. This investigation supports the thesis of the endothelium being part of the inflammation seen in vasculitides, lupus anticoagulans and SLE. Comparisons of cellular and cell-lysate-ELISAs are extremely rare in literature. This investigation added another clue towards the correlation of both methods. Together with the lower susceptibility of antigen-coupling to the solid phase and the increased practicability this makes the lysate-ELISA a good alternative to the cellular ELISA in routine diagnostics. However, application of both assays in different patient groups more often showed significant results using the cellular ELISAs. This investigation indicates that AECA are a heterogenic group of antibodies, as indicated by the leftsided shape of the distribution of AECA-quotients in all examined patient groups. The partial correlation with anticardiolipin-, antiphospholipid- and lupus anticoagulans-antibodies might characterize possible AECA subpopulations. However, it was shown that AECA are not identical with anti-neutrophil-cytoplasmatic antibodies (ANCA), another etiologic autoantibody in the pathogenesis of vasculitides.