Divergent effects of Angiotensin II receptor types 1A and 2 on vascular functions involve NADPH oxidase-dependent oxidative stress and no-dependent guanylyl cyclase

Abstract

Angiotensin II (Ang II) ist ein wichtiges vasokonstriktorisches Agens, welches seine physiologischen Effekte über zwei verschiedene Rezeptoren vermittelt: AT1 und AT2. In Ratte und Maus sind zwei Subtypen des AT1 Rezeptors identifiziert worden, namentlich AT1A und AT1B. Unlängst ist die NADPH Oxidase als wichtigste enzymatische Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) beschrieben worden. Dieses Oxidasesystem scheint durch Ang II über die AT1 Rezeptoren aktiviert zu werden. In der vorliegenden Studie sollte geklärt werden, welche physiologische Bedeutung den Oxidase-Isoformen Nox1 und Nox4 bezüglich des AT1A Rezeptors zukommt. Weiterhin wurde eine mögliche protektive Rolle von AT2 untersucht. Zu diesem Zweck bedienten wir uns knockout Mäusen, in denen entweder das Gen für AT1A (AT1A-/-) oder für AT2 (AT2-/Y) deletiert wurde. Mit Hilfe dieser Modelle bestimmten wir die in vivo Regulation der Nox1 und Nox4 Proteinexpression durch AT1A bzw. AT2 Rezeptoren und deren funktionelle Signifikanz anhand von Superoxidmessungen und Vasorelaxationstudien. Außerdem untersuchten wir die Wechselwirkungen zwischen den Ang II Rezeptoren und dem Stickstoffmonoxid (NO) Signalweg. In isolierten Aorten von AT1A-/- Mäusen fanden wir eine signifikante Downregulation in der Nox1 und Nox4 Proteinexpression im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen (AT1A+/+). Funktionell wurde dies durch eine schwächere 3NT Immunoreaktivität (Biomarker für nitrosativen Stress) und einer geringeren Basalaktivität der NADPH Oxidase unterstrichen. Interessanterweise ging diese Abnahme der NADPH abhängigen Superoxidproduktion einher mit einer erhöhten Effizienz der Acetylcholin-induzierten, endothelabhängigen Gefäßrelaxation. Der Unterschied in der maximalen Gefäßrelaxation zwischen AT1A-/- und AT1A+/+ Mäusen konnte durch SOD und Apocynin aufgehoben werden, was auf eine Beteiligung der NADPH Oxidase abhängigen Superoxidproduktion schliessen lässt. Zusammengefasst weisen diese Daten daraufhin, dass der durch Nox4 (oder Nox1) induzierte nitrosative Stress eine pathophysiologische Rationale des AT1A Rezeptors darstellt, welche in einer beeinträchtigten Gefäßrelaxation resultieren kann. Da Nox4 die unter physiologischen Bedingungen quantitativ bedeutendere Isoform ist, denken wir, dass vor allem dieses Homologe für die AT1A Rezeptors vermittelte ROS-Bildung und ihre Konsequenzen verantwortlich ist. Überraschenderweise konnten in den Aorten von AT2-/Y Mäusen verglichen mit den Wildtyp-Mäusen (AT2+/Y) weder Veränderungen bezüglich der Nox4 Expression noch der NADPH-abhängigen Superoxidproduktion gefunden werden. Allerdings war die Proteinexpression der löslichen Guanylatcyclase (sGCa1/b1) und der endothelialen NO-Synthase (eNOS)in diesem Gewebe erniedrigt, im Gegensatz zu AT1A-/- Mäusen,bei denen kein Unterschied im Vergleich zum Wildtyp detektiert werden konnte. Funktionell äusserte sich die Downregulation dieser NO pathway Enzyme in einer reduzierten Relaxationsantwort auf das Acetylcholin und Spermine NONOate. Zusammenfassend kann man sagen, dass die vorliegenden Daten einen Einblick in die molekularen Mechanismen für die entgegengesetzten Effekte der AT1A und AT2 Rezeptoren im vaskuläresystem geben. Unter physiologischen Bedingungen wirkt dabei der AT1A Rezeptor stimulierend auf die vaskuläre Funktion durch Erhöhung des Nox4 (oder Nox1) vermittelten oxidativen Stress, während der AT2 Rezeptor diese durch Hochregulation von sGC und eNOS hemmt. In diesem Zusammenhang könnte ein selektiver AT1A Rezeptorblocker klinisch von Vorteil sein, indem er die ROS Bildung hemmt, gleichzeitig aber den protektiven NO Signalweg unberührt läßt. Ang II is a potent vasoconstrictor agent and elicits its physiological effects on the vasculature via two distinct receptors AT1 and AT2. Among AT1 receptors, two subtypes, AT1A and AT1B have been identified in rat and mouse. Recently, NADPH oxidase has been identified as a major enzymatic source of ROS in the vasculature. It is widely accepted that AT1 receptors are predominantly involved in NADPH derived ROS formation. However, there is no available information concerning the in vivo regulation and functional significance of Nox1 and Nox4 by Ang II under physiological conditions. Therefore, we took advantage of Ang II (AT1A or AT2) receptors-deficient mice (AT1A-/- and AT2-/Y) as powerful tools to examine the expressional regulation and functional consequences of Nox1 and Nox4 by Ang II (AT1A and AT2) receptors under these conditions. Besides, we attempted to investigate the functional interplay between Ang II receptors (AT1A and AT2) and NO signalling pathway. In the isolated aorta of mice genetically deficient in the AT1A receptor, we observed that Nox1 and Nox4 levels were significantly downregulated versus their respective AT1A+/+ mice. Functionally, this was associated with attenuated 3NT immunoreactivity (a stable biomarker of nitrosative stress) and the basal activity of NADPH oxidase. Interestingly, this decrease in NADPH-dependent O2-? production was exclusively reflected in an increased efficacy of ACh-induced endothelium-dependent relaxation. Importantly, the difference in maximal relaxation-induced by ACh between AT1A-/- and AT1A+/+ mice was inhibited by either SOD or apocynin, suggesting that indeed NADPH oxidase-derived O2-? formation is involved. However, Nox2 protein level remained unchanged in the aorta of AT1A-/- and AT2-/Y mice compared to their respective wt. Collectively, these findings provide in vivo evidence for Nox4 and Nox1-induced oxidative stress as a pathophysiological mechanism of AT1A receptors-impaired endothelium-dependent vasodilatation. Furthermore, based on the fact that Nox4 as being quantitatively the most relevant isoform under physiological conditions, we suggest that this isoform may predominantly contribute to these functional consequences. Surprisingly, in the aorta of AT2-/Y mice, there was neither alteration in Nox4 expression nor in NADPH oxidase-dependent O2-? production compared to that in AT2+/Y mice. Of interest, the aorta of these mice exhibited a marked downregulation in NO receptor cyclase subunits sGC a1/b1 and eNOS protein expression compared that in AT2+/Y mice. Nevertheless, in the aorta of AT1A-/- mice, the protein expression of a1/b1 subunits as well as eNOS protein expression remained unchanged compared to that in AT1A+/+ mice. Functionally, the downregulation in NO solubale guanylyl cyclase receptors a1/b1 as well as eNOS expression levels was reflected in reduced sensitivity or affinity to ACh as well spermine NONOate induced endothelium dependent or independent vasodilatation in the aorta of AT2-/Y mice, respectively. In conclusion, our data provide, an important evidence for the molecular mechanisms of countervailing effects of AT1A (stimulatory) and AT2 (inhibitory) receptors on vascular functions by upregulation of Nox4 (or Nox1)-mediated oxidative stress versus the NO-sensitive guanylyl cyclase under physiological conditions. Thus, selective AT1 receptor blockade may be clinically advantageous by inhibiting detrimental ROS formation and simultaneously leaving the beneficial sGC signaling untouched.