MMP- und TIMP-Isoformen in Pleuraergüssen unterschiedlicher Genese und physiologischer Pleuralavage

Abstract

Matrix-Metalloproteasen (MMP) und deren Inhibitoren, die Tissue Inhibitors of Metalloproteases (TIMP) spielen eine grundlegende Rolle in der Zusammensetzung der Extrazellulären Matrix (EZM). In physiologischen und pathologischen Situationen ist die Kontrolle des Gleichgewichtes zwischen proteolytischer Aktivität (MMP) und antiproteolytischer Aktivität (TIMP) von eminenter Wichtigkeit. So beobachtet man bei degradativen Prozessen oft ein Überwiegen der proteolytischen Aktivität, wohingegen es bei fibrotischen Prozessen oft zu einem Überschuss der antiproteolytischen Aktivität kommt. Der Pleuraraum ist eng begrenzt durch Pleura parietalis und Pleura visceralis. Im physiologischen Zustand ermöglicht die leichte Verschieblichkeit der Pleurablätter gegeneinander die Atemmechanik, so dass der Zusammensetzung der EZM des Pleuraraumes eine entscheidende Rolle zuteil wird. Entzündliche Prozesse der Pleura können als Folge Verschwartungen und Verklebungen und somit restriktive Ventilationsstörungen der Lunge nach sich ziehen. Da diese erfreulicherweise selten entstehen, weist dies auf eine hohe Heilungstendenz und somit hohe Expression von Proteasen hin. Folglich ist die genaue Betrachtung des Proteasen-Antiproteasen-Verhältnisses im Pleuraraum von grundlegender Bedeutung für eine Aussage über die enzymatische Aktivität der MMP. In dieser Arbeit wurden 96 Pleuraergüsse unterschiedlicher Genese auf die Anwesenheit von MMP und TIMP untersucht, dieses Profil wurde verglichen mit 10 Pleuralavagen, welche eine normale Kontrollgruppe darstellen. Der Nachweis der gelatinolytischen Aktivität von MMP-2 und MMP-9 erfolgte mittels Gelatinzymographie. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen von MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 mittels ELISA-Technik ('enzyme-linked immuno sorbent assay') bestimmt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MMP-2, TIMP-1 und TIMP-2 in hohen Konzentrationen im Pleuraraum vorhanden sind, wobei eine deutliche Dominanz von MMP-2 und TIMP 1 ersichtlich ist. MMP-2, TIMP 1 und TIMP-2 waren in allen Proben (Pleuraergüssen, Transsudaten und Pleuralavagen) nachweisbar. MMP-1 und MMP-9 hingegen konnten nicht in Pleuralavagen nachgewiesen werden. Im Vergleich zu den Pleuralavagen liegt also bereits bei Transsudaten eine Veränderung vor, die mit einer Induktion der Expression von MMP-1 und MMP-9 einhergeht. Der oft genommene Vergleich von Transsudaten mit physiologischer Pleuraflüssigkeit ist somit zurückhaltend zu gebrauchen. Darüber hinaus ist der MMP-9 Gehalt in parapneumonischen Exsudaten signifikant erhöht, verglichen mit Transsudaten oder paraneoplastischen Exsudaten. Somit würde eine von Transsudaten über paraneoplastische Exsudaten bis hin zu parapneumonische Exsudaten zunehmende Expression von MMP-9 für eine zunehmende Zerstörung der funktionellen Proteinschranke zwischen Kapillar- und Pleuraraum sprechen. Pathologische Veränderungen im Pleuraspalt spiegeln sich somit am Vorkommen der MMP-1 und MMP-9-Isoformen wider. Mittels Gelatinzymographie waren in allen Pleuraergüssen die aktivierte Form von MMP-2 und MMP-9 als Doppelbande nachweisbar. Auffällig war das Fehlen der Doppelbande, der aktivierten Form, in allen Pleuralavagen. Weiterhin konnten wir eine signifikante Abnahme des TIMP-2 Gehaltes in allen pathologischen Proben beobachten (Transsudate und Exsudate), verglichen mit den Pleuralavagen. Ob es sich bei der Reduktion um einen Verbrauch der Antiprotease handelt, kann nur spekuliert werden. Ergibt die nähere Betrachtung von MMP-2 mit ihrem korrespondierendem Inhibitor, TIMP-2, ein Überwiegen der proteolytischen Seite, so zeigt interessanterweise die Analyse von MMP 1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 ein Überwiegen der antiproteolytischen Seite an. Anhand der Messungen der MMP- und TIMP-Isoformen in Pleuraergüssen und Pleuralavagen ließen sich MMP-2, TIMP-1 und TIMP-2 als konstitutive Isoformen einteilen, wohingegen MMP-1 und MMP-9 als induzierte Isoformen gelten dürften. Eine Analyse von MMP- und TIMP-Isoformen ist daher hilfreich bei der Unterscheidung zwischen Transsudat und Exsudat, aber als alleinige Parameter sind diese nicht ausreichend. Die signifikanten Unterschiede einzelner MMP- und TIMP-Isoformen geben interessante Auskünfte über die Pathophysiologie der Pleuraergüsse und transsudate. In zukünftigen Studien wäre es daher von hohem Interesse, ob eine induzierte Verschiebung des MMP/TIMP Gleichgewichtes in der Pleura mit einer Ergussentwicklung einhergeht. The matrix metalloproteases (MMP) and their endogenous inhibitors, the tissue inhibitors of metalloproteases (TIMP), are key enzymes controlling the turnover of the extracellular matrix (ECM). A balanced control of proteolytic and antiproteolytic activities by MMP and TIMP, respectively, is of ultimate importance for homeostasis of the ECM. In the lung, dysregulated MMP/TIMP activity has been shown to contribute to many pathophysiological situations: Increased proteolytic activity is frequently associated with degradative processes (COPD), whereas increased antiproteolytic activity has often been associated with fibrotic processes (lung fibrosis, asthma). The pleural space is confined by the visceral and the parietal pleural. Under physiological conditions, a small amount of pleural fluid between these two pleural layers facilitates the movement of the lungs against the thorax, and as such, enables breathing. The distinctive composition of the pleural fluid, especially with regard to the expression of proteolytic and antiproteolytic enzymes is therefore of fundamental interest, as inflammation within the pleural space can led to restrictive ventilation due to interpleural adhesions or pleural fibrosis. To make any conclusions about the enzymatic activity of MMPs in the pleural space, an accurate and quantitative analysis of the protease-antiprotease-balance within pleural liquid and effusions are thus required. In the current study, we investigated the expression of MMPs and TIMPs in 96 pleural effusions of different origins by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), which quantitate the concentrations of MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2. The MMP- and TIMP-profile from pleural effusions was then compared to 10 pleural lavages, which represents the healthy control group. In addition to ELISAs, the gelatinolytic activity of MMP-2 and MMP-9 was also examined by gelatin-zymography. In all samples analyzed (pleural effusions, transudates, and pleural lavages), MMP-2, TIMP-1, and TIMP-2 were detectable at high concentrations, with MMP-2 and TIMP-1 being the dominant isoforms. In contrast, MMP-1 and MMP-9 were expressed in pleural effusions, but could not be detected at all in pleural lavages. Compared to pleural lavages, transudates were already altered with respect to the expression of MMP-1 and MMP-9. Thus, the frequently used designation of transudates as a representative to physiological pleural fluid has to be used carefully. With respect to MMP expression in pleural effusions of different origin, the concentration of MMP-9 in parapneumonic exudates is significantly increased compared to transudates or paraneoplastic exudates. Thus, an increased expression of MMP-9 in parapneumonic exudates may provide compelling evidence of the enhanced breakdown of the physiological protein barrier between capillary and pleural space. As a consequence, pathologic alterations within the pleural space are likely represented by the detection of MMP-1 and MMP-9. The active forms of MMP-2 and MMP-9 was observed in all pleural effusions as a double band, shown by gelatin zymography. Interestingly, however, no active forms of MMP-2 and MMP 9 were detected in all pleural lavages. With respect to TIMP expression, a significant decrease of TIMP-2 in all pathological samples (transudates and exudates) compared to the pleural lavages was detected. Our data provide compelling evidence that MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2 serve as constitutively expressed isoforms in pleural liquid, the physiological function of which is probably to guarantee homeostasis of pleural liquid. In contrast, MMP-1 and MMP-9 are induced by pathophysiological conditions. The determination of MMP- and TIMP-isoforms may therefore be helpful in differentiating transudates from exudates. The significant differences of the MMP- and TIMP-isoform pattern may explain the pathology represented in pleural effusions and transudates. In further animal studies, it would be interesting to show if an induced shift of the MMP/TIMP balance in the pleural space would be sufficient to produce pleural effusions.