Angiogenesehemmung durch niedermolekulare Peptidantagonisten des Vitronektinrezeptors : Modellversuche an der Retina der Maus

Abstract

Einleitung: Mikrovaskuläre Veränderungen bei Diabetes mellitus sowie Frühgeborenen-retinopathie und andere ischämische Netzhauterkrankungen führen zu unkontrollierter Gefäß-neubildung in der hypoxischen Netzhaut. Im Mausmodel hypoxieinduzierter Retinopathie hemmen niedermolekulare Peptidantagonisten des Integrinrezeptors vom Vitronektintyp (VNR) retinale Neovaskularisationen (RNV) sehr effektiv, wenn eine systemische Behandlung vor dem Einsetzen der Angiogenese begonnen wird (Hammes et al., 1996). Klinisch relevante Fragestellungen sind, ob dieser Ansatz bei präexistierenden und aktiven retinalen Neovaskularisationen effektiv ist und, ob VNR-Peptidantagonisten topisch appliziert werden können, da anhaltende systemische Verabreichung das Risiko unerwünschter Wirkungen birgt und wiederholte intraokuläre Injektionen klinisch impraktikabel sind. Zielsetzung war es, a) die Dynamik der Integrin- und Wachstumsfaktorexpression in dem Mausmodell sauerstoffinduzierter Retinopathie, b) die Ligationshemmung des VNR als Sekundärinterventionsansatz nach dem Beginn der Angiogenese und c) die hemmende Kapazität des RGD-Peptidantagonisten auf präretinale Neovaskularisationen nach topischer Applikation in Form von Augentropfen zu untersuchen. Methoden: Sieben Tage alte Mäuse wurden für fünf Tage 75%igem Sauerstoff ausgesetzt. Nach der Rückkehr in Raumluft wurde die Kinetik retinaler Angiogenese a) durch Western-Blot-Analyse der Expression des alphav-Integrins sowie des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors und des Fibroblastenwachstumsfaktors und b) mittels Fluoreszenzangiographien und quantitativer Histologie an verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Den Ergebnissen zufolge wurde die fünftägige systemische Therapie verschiedener Dosierungen des RGD-Peptids mit einer Verzögerung von zwei beziehungsweise fünf Tagen nach der Rückkehr in Raumluft eingeleitet. In einem Augentropfen-Therapieansatz wurde der Peptid-Antagonist in einer speziell hergestellten Lösung topisch appliziert. Das jeweilige Therapieergebnis wurde mittels Fluoreszenzangiographien und quantitativer Histologie evaluiert. Ergbenisse: Direkt nach Beginn der Hypoxiephase war die alphav-Integrinexpression am ausgeprägtesten, es folgte ein schneller Rückgang. Die VEGF-Expression war während der initialen Angiogenesephase erhöht und sank anschließend auf basale Werte, während FGF-2 während der gesamten Angiogeneseperiode ausgeprägt war. Maximale Gefäßneubildung wurde zwischen dem Tag p17 und p19 beobachtet. Der frühe Sekundärinterventionsansatz reduzierte präretinale Neovaskularisationen dosisabhängig mit einer maximalen Hemmung von 56%. Die weiter verzögerte Therapie zeigte auch mit der Maximaldosis keinen Effekt. Bei der histologischen Begutachtung parenchymatöser Organe wie Herz oder Niere wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Die Augentropfentherapie erbrachte eine dosisabhängige Wirkung mit einem Maximaleffekt von 48%. Schlussfolgerung: Mit niedermolekularen Integrin-Peptidantagonisten kann eine wirkungsvolle Inhibition eines aktiven Angiogeneseprozesses ohne erkennbare Nebenwirkungen erzielt werden. Frühzeitige Intervention ist hierbei von entscheidender Bedeutung. Nach den Ergebnissen ist die angiogeneseassoziierte alphav-Integrinexpression eher VEGF- als FGF-2 abhängig und die Effektivität der RGD-Therapie bei angioproliferativer Retinopathie ist nur solange gegeben, wie das Zielmolekül exprimiert wird. Größe und biochemische Eigenschaften des Peptids ermöglichen seine topische Applikation und wirkungsvolle Hemmkonzentrationen an der Netzhaut. Dieser Ansatz ermöglicht es, potentielle Nebenwirkungen zu minimieren und den therapeutischen Effekt zu maximieren. Er stellt eine klinisch durchführbare Langzeitapplikationsform dar, die systemische Verabreichung und intraokuläre Injektionen umgeht. Purpose: Microvascular abnormalities in diabetes as well as retinopathy of prematurity and other ischemic retinopathies lead to the uncontrolled formation of new blood vessels in the hypoxic retina. In the murine model of hypoxia induced retinopathy small peptide antagonists of the vitronectin type integrin receptor (VNR) inhibit retinal neovascularization (RNV) highly effective when systemic treatment is initiated prior to the onset of angiogenesis (Hammes et al., 1996). Clinically relevant questions remain whether this approach is effective on preexisting and active retinal neovascularization and whether antagonists of the VNR can be topically administered as long as systemic applications carry the risks of side effects and repeated intraocular injections are impracticable within the clinical setting. The aim of this study was to investigate a) the dynamics of integrin and growth factor expression in the murine model of oxygen induced retinopathy, b) ligation inhibition of the VNR as a secondary intervention after the onset of angiogenesis and c) the efficacy of the RGD-antagonist in inhibiting RNV when topically applicated by the means of eye drops. Methods: Seven day old mice were exposed to 75% of oxygen for five days. After the return to room air the kinetics of angiogenesis in the retina was studied by analyzing a) the expression of áí-type integrins, vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor-2 by performing western blot analysis and b) the time course of neovascularization by performing fluorescein angiographies and quantitative histology. Based on the findings systemic treatment with varying doses of RGD-peptide was initiated with a delay of two or five days after the return to room air and was continued for five days. In a topical application trial the peptide antagonist was epicorneally administered in a specially developed eye drop solution. The effect of the treatments was evaluated by fluorescein angiographies and quantitative histology. Results: Immediately after induction of hypoxia, expression of alphav-type integrins was highest and then rapidly declined. VEGF expression was high during the initial phase of angiogenesis and then declined to baseline levels, while bFGF was continuously present throughout the neovascularization period. Maximal extent of angiogenesis was noted between day p17 and p19. Early secondary intervention treatment reduced preretinal neovascularizations in a dose dependent manner with a maximum of 56%. Delayed secondary intervention had no inhibitory effect of preretinal neovascularization, even at the maximum efficient dose of earlier treatments. No side effects have been observed by histological examination of parenchymal organs such as heart or kidney. RGD-eye drop treatment reduced preretinal endothelial cell nuclei dose dependently with a maximum of 48%. Conclusion: With low molecular weight integrin antagonists the effective inhibition of an ongoing process of angiogenesis can be achieved without detectable side effects. Timely intervention is of crucial importance for the efficacy of this approach. The findings indicate that angiogenesis related alphav-integrin expression is VEGF- rather than FGF-2-dependent, and the efficacy of RGD-treatment in proliferative retinopathy is only effective as long as the alphav-integrin target is predominantly expressed. The cRGDfV-antagonist used is a small pentapetide of which size and biochemical properties enable topical application and lead to sufficient concentrations in the retina to inhibit angiogenesis after epicorneal administration. The topical application by the means of eye drops has the potential of maximizing the therapeutic effect of angiostatic agents while minimizing possible, yet unknown, systemic side effects. It reflects a clinically feasible long term application method that circumvents systemical delivery and intraocular injections.