Untersuchungen zur Genexpression von primären humanen Endothelzellen nach Infektion mit Chlamydophila pneumoniae

Abstract

Chlamydophila pneumoniae ist ein gram-negatives, obligat intrazelluläres Bakterium. Beim Menschen ist es als Erreger von Infektionen des oberen und unteren Respirationstraktes weit verbreitet. Seit einigen Jahren mehren sich die Hinweise für eine C. pneumoniae vermittelte Initiation oder Akzelleration der Arteriosklerose. Der pathogenetische Zusammenhang ist jedoch noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Reaktionen von humanen Endothelzellen auf Infektion mit C. pneumoniae zu untersuchen. Von besonderem Interesse waren hierbei Hämostasefaktoren (Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) und Thrombomodulin (TM)) und frühe Transkriptionsfaktoren (c-jun, c-fos, Egr-2/KROX-20). Zu diesem Zweck wurden sowohl C. pneumoniae als auch humane umbilikal-venöse Endothelzellen (HUVE-Zellen) kultiviert. Die HUVE-Zellen wurden daraufhin mit C. pneumoniae infiziert, inkubiert und nach bestimmten Zeiten analysiert. Als Vergleich diente eine nicht infizierte Referenzgruppe. Die Analyse der Endothelzellreaktion erfolgte im Bezug auf Zellaktivität, mRNA-Expression und Protein-Synthese. Die verwendeten Verfahren waren Northern Blot, zellulärer Enzyme-linked immuno sorbent Assay (ELISA) und Western Blot. Bei den untersuchten Hämostasefaktoren zeigte sich nach 24 Stunden eine erniedrigte Thrombomodulin-mRNA-Expression (um 20%) und eine erhöhte PAI-1-mRNA-Expression (um 40%) gegenüber der Kontrollgruppe. Die Differenz zu der Kontrollgruppe ließ sich bei der PAI-1-mRNA-Expressionskinetik noch bis zu 48 Stunden nach Infektion nachweisen. In der Präsenz von Thrombomodulin an der Zelloberfläche konnte mittels eines zellulären ELISAs ebenfalls ein Unterschied zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Es fand sich ein Rückgang des Thrombomodulin-Antigens um 20-30% in einem Zeitraum von 48 Stunden nach der Infektion. Es konnte eine deutliche Erhöhung der mRNA-Expression der untersuchten frühen Transkriptionsfaktoren festgestellt werden. Bei allen kontrollierten Zeitpunkten zeigte sich ein Expressionsunterschied von infizierten Zellen zu nicht infizierten. Ein Maximun erreichte die Expression nach 30 Minuten bei c-jun und Egr-2/KROX-20, nach 1 Stunde bei c-fos. Im Western Blot wurde bei infizierten Zellen ebenfalls eine Erhöhung von c-jun/AP-1 ermittelt. Die Ergebnissse legen nahe, daß eine Infektion mit C. pneumoniae humane Endothelzellen in einen aktivierten, prokoagulatorischen Zustand versetzen. Eine Infektion mit C. pneumoniae bewirkt somit pro-arteriosklerotische Veränderungen der Gefäße. Ob dies jedoch in der klinischen Praxis eine Rolle spielt, kann man aufgrund dieser Ergebnisse nicht vorhersagen. Diese Aussage muß weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben. Chlamydophila pneumoniae is a gram-negative, intracellular bacterium. It is well known as cause of upper and lower respiratory tract infections. For some years evidence has been found that C. pneumoniae induces or accelerates atherosclerosis. However, the underlying pathophysiology still remains unclear. It was therefore aim of this study to examine the effects of C. pneumoniae infections on endothelial cells which are involved in the process of atherosclerosis. This study focuses on hemostasis factors, such as plasminogen-activator-inhibitor-1 (PAI-1) and thrombomodulin (TM), as well as immediate early transcription factors, such as c-jun, c-fos and Egr-2/KROX-20. Human umbilical venous cells (HUVEC) were infected with C. pneumoniae isolated from a patient suffering from an acute infection. The mRNA respectively protein expression of infected HUVE-cells were analysed and compared to not infected control cells. HUVE-cells showed a significantly decreased thrombomodulin- and a significantly increased PAI-1-mRNA-expression 24h after infection with C. pneumoniae. The presence of thrombomodulin at the cell surface was decreased to up to 30% as analyzed using a cellular ELISA. The analysis of immediate early transcription factors unveiled a strong increase of c-jun, c-fos and Egr-2/KROX-20 mRNA shortly after infection showing maximal mRNA levels at 30-60min after infection. Additionally an increase of the important proinflammatory transcription factor c-jun/AP-1 was observed on protein level by Western Blot analysis. The results show that infection with C. pneumoniae alters the expression patterns of endothelial cells towards an activated, procoagulatory state. An infection with C. pneumoniae leads to pro-atherosclerotic changes in endothelial cells supporting the hypothesis that C. pneumoniae can act as an initiating and accelerating factor in the cause of atherosclerosis. However, if this is an important risc factor for developing atherosclerosis in patients cannot be answered by this study. This has to be analysed in further patient orientated studies.