Die Surfactantkonversion als enzymatischer Prozeß : Ist das Surfactantprotein SP-B ein Substrat der Konvertase?

Abstract

Das in der Alveole der Säugerlungen vorkommende Surfactantmaterial kann in sogenannte small und large surfactant aggregates aufgetrennt werden. Zu den large surfactant aggregates zählen Lamellarkörperchen und tubuläres Myelin, also die biophysikalisch hochaktiven Präkursoren des interfacialen Surfactantfilms. Unter den Prämissen einer akuten respiratorischen Insuffizienz ist wiederholt festgestellt worden, dass die Verteilung zwischen den large surfactant aggregates und small surfactant aggregates sehr zugunsten der small surfactant aggregates verschoben ist. Hieraus resultierend findet sich ein Übergewicht dieser, biophysikalisch weitgehend inaktiven, Abbauprodukte des Grenzflächenfilms. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Doktorarbeit der Fragestellung nachgegangen, wodurch die alveoläre Umwandlung der large in die small surfactant aggregates, ein als Surfactantkonversion bezeichneter Vorgang, vermittelt wird, und ob diese Surfactantkonversion ein enzymatisch getriggerter Prozess ist. Zur Beantwortung dieser Frage wurde als Ausgangsmaterial eine gepoolte bronchoalveoläre Lavage von gesunden Kaninchen, sowie ein rekonstituiertes Surfactantmaterial verwendet. Methodisch kamen weiterhin chromatographische, elektrophoretische, biophysikalische Verfahren, sowie Enzymaktivitäts-Assays zur Anwendung. Zunächst einmal konnte festgestellt werden, dass für die weitreichende Konversion von Surfactant in vitro in der Tat die Gegenwart einer Esterase notwendig ist. Weiterhin ergab sich im Rahmen der Rekonstitutionsversuche mit variablen Surfactant-Apoproteinen ebenfalls der Hinweis, dass vor allen Dingen der relative Gehalt an SP-B einen weitreichenden Einfluss auf den Konversionsgrad ausübt. Bei der Untersuchung der Herkunft der Esteraseaktivität in der BAL zeigte sich, dass im Überstand der resuspendierten Zellen der bronchoalveolären Lavage, wie auch im Zelllysat erhebliche Mengen an Esteraseaktivität nachweisbar waren. Weiterhin wurde festgestellt, dass unter den Bedingungen einer in vitro Konversion die Esteraseaktivität in den Subfraktionen alveolären Surfactans zeitabhängig abfiel. So war in den large surfactant aggregates 42 min nach Beginn der in vitro Konversion überhaupt keine Esteraseaktivität und nur noch etwa ein Viertel der Amidaseaktivität nachweisbar. Auf der Suche nach dem möglichen Substrat dieser Esterase wurde sowohl für die natürliche, wie auch für isoliert mit - an Sepharose gekoppelter - Esterase inkubiertem Surfactantprotein B der Nachweis erbracht, dass im Rahmen des Konversionsprozesses das dimere SP-B abgebaut und ein Spaltprodukt in einem Molekulargewichtsbereich von 11-14 kDa neu auftritt. Eine aminoterminale Sequenzierung dieses Spaltproduktes ergab zweifelsfrei den Nachweis eines Surfactantprotein B entstammenden Proteins und zwar des aminoterminalen Anteils des SP-B. Dieses Spaltprodukt konnte durch ein neu entwickeltes HPLC-Verfahren zur Auftrennung der hydrophoben Surfactantproteine aus der BAL weiter aufgereinigt werden. Zusammenfassend ergibt sich auf der Basis der hier vorliegenden Daten der Befund, dass die Umwandlung von large in small surfactant aggregates und der hiermit verbundene Verlust der Oberflächenaktivität nicht nur von der Größe der Oberflächenveränderung, sondern zudem von der Gegenwart einer enzymatischen Aktivität abhängig sind. Im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchung konnte der Nachweis einer Esteraseaktivität sowohl in den Zellen der BAL, wie auch im zellfreien Überstand erbracht werden. Als mögliches Substrat dieser Aktivität konnte das Surfactantprotein B identifiziert werden, für welches das Auftreten eines 11-14 kDa großen Spaltproduktes einwandfrei belegt werden konnte. Aus der Kenntnis dieser Ergebnisse leiten sich mögliche neue Therapieoptionen für das Acute Respiratory Distress Syndrome, wie auch für den Ventilator Induced Lung Injury ab, bei denen Verschiebungen des alveolären Surfactantpools zugunsten der small surfactant aggregates wiederholt beschrieben worden sind. The alveolar surfactant pool can be separated into the 'large surfactant aggregates' (LSA) and the 'small surfactant aggregates' (SSA). The LSA, including lamellar bodies and tubular myelin, represent the biophysically highly active precursors of the interfacial surfactant film. Under cyclic area changes LSA are converted into the SSA (surfactant conversion). In contrast to LSA the SSA are clearly less surface active. Under clinical conditions of the acute respiratory distress syndrome, the balance of LSA to SSA is found to be switched in favour of SSA. Under these conditions, the alveolar surfactant pool predominantly consists of the largely inactive small surfactant aggregates, thus favouring impairment of gas exchange and lung function. Drawn against this background we aimed to elucidate the mechanisms of the conversion process. To answer this question pooled bronchoalveolar lavages of healthy rabbits and reconstituted surfactant preparations were subjected to repetitive surface area changes in vitro and extend of conversion was analysed. Besides chromatographic, electrophoretic and biophysical techniques, enzyme activity assays were applied for experimental investigations. It was found that an esterase activity is necessary for the induction of surfactant conversion under cyclic surface area changes. Experiments with various concentrations of the different surfactant proteins SP-A, SP-B or SP-C in reconstituted lipid mixtures revealed that only SP-B has a profound impact on the extent of in vitro conversion. Enzyme activity assays showed high esterase activity in complete cell suspensions of bronchoalveolar lavage and cell lysates. Under conditions of in vitro conversion, the esterase activity was found to decline in dependency of the incubation time, resulting in complete loss of esterase activity after 42 min of in vitro conversion. With emphasis on the potential role of surfactant proteins as substrates of esterase activity, we could show that in vitro conversion of BAL as well as incubation of isolated SP-B with sepharose linked esterase would result in a cleavage of dimeric SP-B and detection of a new protein band with a molecular range of 11-14 kilodalton. Amino terminal sequencing revealed that this protein truly represents a cleavage product of the amino terminal part of SP-B. Further purification of the cleavage product was performed by a new developed HPLC method for separation from other hydrophobic surfactant proteins and phospholipids. In summary the presented data support the conclusion that conversion of large surfactant aggregates to small surfactant aggregates not only depends on cyclic changes of the air-liquid interface, but also on the presence of an esterase activity. This esterase activity was detected in the cytosolic fraction of BAL cells, mostly alveolar macrophages. A SP-B cleavage product with a molecular range of 11-14 kilodalton was identified upon in vitro incubation of esterase with SP-B and after in vitro conversion of a rabbit BAL pool, suggesting that SP-B is a substrate of the alveolar esterase. These data may help to identify new molecular targets to treat acute respiratory distress syndrome and ventilator induced lung injury.