Die Common Variant-Common Disease Hypothese in der Fehlsteuerung der Immunantwort : Assoziation zwischen Genotyp und Phänotyp am Beispiel des Interleukin-4 Rezeptor und Tumor-Nekrose- Faktor Gens

Abstract

Der Krankheitsverlauf nach einem Polytrauma wird wesentlich von einer unkontrollierten Entzündungsreaktion des Organismus bestimmt, an dem sowohl Reaktionen des angeborenen als auch adaptiven Immunsystems beteiligt sind. Die Beobachtung, dass Patienten mit gleichem Verletzungsmuster unterschiedlich auf ein Polytrauma reagieren (Sepsis-Syndrom vs. non- Sepsis- Syndrom, lässt genetische Unterschiede vermuten, die folglich zu einem ungleichen Verhältnis von pro-und anti-inflammatorischen Zytokinen führen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das proinflammatorische TNF Gen, das einen wesentlichen Trigger der systemischen Entzündungsreaktion (SIRS) nach einem Polytrauma darstellt, sowie das anti-inflammatorische IL-4, das für den Th1/Th2 Wechsel während des Sepsis-Syndroms bedeutend ist. Die Wirkungen des IL-4 wurden am Beispiel seines Bindungspartners, dem IL 4R Komplex mit der IL-4R alpha Kette als Hauptkomponente untersucht. Der Einfluss einzelner genetischer Varianten auf das Sepsis Syndrom wurde bisher in zahlreichen genetischen Assoziationsstudien untersucht, die diskrepante Ergebnisse lieferten. Mögliche Ursachen liegen in der Planung und Durchführung von Studien. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden am Beispiel der hoch polymorphen IL-4R alpha Kette natürlich vorkommende kodierende IL4R Genvarianten, die zu einem Aminosäureaustausch am Rezeptorprotein führen, auf die Common Variant- Common Disease (CV-CD) Hypothese untersucht. Über Mutagenese und Transfektion der erstellten IL4R Konstrukte wurde in funktionellen Studien der Einfluss der verschiedenen IL4R Genvarianten auf die intermediären Phänotypen Zellproliferation und CD23 Expression untersucht. Ein Unterschied zwischen Zellen, die eine Aminosäuresubstitution exprimierten und Zellen, die den Wildtyp exprimierten, konnte in Bezug auf die beiden Phänotypen Zellproliferation und CD23 Expression nicht festgestellt werden. Im Anschluss bei der genetisch-epidemiologischen Analyse der bekannten IL4R Polymorphismen zeigte sich ebenso, dass weder ein IL4R Polymorphismus noch ein IL4R Haplotyp signifikant assoziiert war mit dem quantitativen Phänotyp Serum-IgE Spiegel. Folglich wurde die CD-CV Hypothese für die natürlich vorkommenden kodierenden IL4R Varianten verworfen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Assoziationsstudien bei einem Sepsis-Syndrom nach einem Polytrauma nach Kriterien der modernen genetisch-epidemiologischen Methodik repliziert. In einer prospektiven Kohortenstudie, die 159 Patienten mit einer Mehrfachverletzung einschloss, wurde der Einfluss nicht kodierender TNF Genvarianten auf den TNF alpha Plasmaspiegel, auf die Entstehung einer Sepsis sowie auf die Prognose untersucht. Über einen Zeitraum von 14 Tagen wurden die TNF-alpha Plasmaspiegel der Patienten täglich erfasst. Zusätzlich wurde bei den Patienten eine Genotypisierung der wichtigsten TNF und LTA Polymorphismen vorgenommen. Bei der Analyse der Polymorphismen der TNF Genregion wurde festgestellt, dass das TNF-308A Allel sowie das LTA+252G Allel signifikant assoziiert sind mit dem TNF alpha Plasmaspiegel, mit der Entstehung von Sepsis und der Prognose nach einem Polytrauma (p<0,0001). Die Assoziation geschätzter Haplotypen zeigt, dass insbesondere der Haplotyp TNF-308A/LTA+252G signifikant assoziiert ist mit den oben genannten Phänotypen. Die TNF Genotypisierung bietet daher künftig die Möglichkeit, Hochrisikopatienten zu erfassen und diesen eine gezielte präventive Therapie zukommen zu lassen. The disease process in severely injured patients is basically determined by an unregulated inflammatory response of the host, which are often contributed to both, the innate and the adaptive immune system. Patients encountering similar injuries react in a different manner after a trauma (sepsis-syndrome vs. non-sepsis-syndrome). This may be due to genetic variation leading to imbalance of pro- and anti- inflammatory cytokines.The signature cytokines of this thesis are the proinflammatory TNF gene, which is a pivotal trigger of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) after severe injury as well as the anti-inflammatory IL-4 gene, which promotes the Th1/ Th2 switch in sepsis syndrome. The effects of IL-4 were assessed on its binding partner, the IL4R complex with the IL-4R alpha chain as the main component. The impact of single gene variants on sepsis syndrome was examined in several association studies, which have led to controversial findings. The disparate results of these studies may be due to differences in undertaking association studies. In the first part of this thesis we studied the Common Variant- Common Disease (CV-CD) hypothesis regarding common IL4R coding SNPs, which led to amino acid substitutions at the receptor protein. After mutagenesis and transfection of different IL-4R constructs we analyzed the functional impact of the IL-4R amino acid substitutions on the intermediate phenotypes, IL-4 induced cell proliferation and CD23 expression. However, the analysis of responsiveness to IL-4 of transfectants carrying either the variant IL-4Ra chain or the wild type IL-4R alpha chain did not reveal any difference in IL-4 induced cell proliferation and CD23 expression. Furthermore, the analysis of all known coding IL4R variants and common haplotypes in blood donors did not indicate a significant association with the phenotype total serum IgE level. Therefore, we rejected the CV-CD hypothesis regarding common coding variants of the IL4R gene. The second part of the thesis comprised the replication of association studies on the role of TNF-alpha and TNF gene variants in sepsis syndrome including modern genetic epidemiological methods. After inclusion of 159 severely injured patients in a prospective cohort study, the association of non coding TNF gene variants with TNF-alpha production, the development of sepsis syndrome and the predictive value of these markers for outcome were assessed.For this reason we genotyped most of all TNF and LTA gene variants. A significant association for the incidence of sepsis after multiple trauma was observed for the TNF-308A allele and the completely linked LTA+252G allele (p<0.0001). Additionally, both alleles showed significant association with elevated TNF-a plasma levels and death after severe injury. In conclusion, the presence of one or two copies of the TNF-308A/ LTA+252G haplotype is strongly predictive for the above mentioned phenotypes. Clinically, genotyping of TNF gene variants may help to identify patients, who are at risk to develop sepsis syndrome and to permit the initiation of preemptive anti-inflammatory therapy to reduce mortality.