Quantitative Bestimmung von ZPA-, ZPB- und ZPC-mRNA in Oozyten unterschiedlicher Follikelgröße des Marmoset Affen

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Lokalisation der de novo Synthese der ZP-Glykoproteine ZPA, ZPB und ZPC in Gewebeschnitten des Marmoset Affen untersucht. Hierzu wurden mehrere spezifische Ribosonden gegen die entsprechenden ZP-Glykoprotein-mRNAs hergestellt, gereinigt und für den Einsatz in einer in situ Hybridisierung auf Formalin fixierten Gewebeschnitten von Marmoset Ovarien optimiert. Mit Sonden gegen jeweils unterschiedliche Bereiche der entsprechenden mRNA-Moleküle waren ZPA-, ZPB- und ZPC-Transkripte im Marmoset Ovar nachzuweisen. Besonders intensive Reaktionen konnten im Zytoplasma der Follikelzellen von Prämordialfollikeln bis zu Tertiärfollikeln festgestellt werden. Auch in den Oozyten konnten ZP-mRNA Transkripte nachgewiesen werden. Allerdings nahm die Farbreaktion im Laufe der Follikulogense ab; die Intensität der Reaktion war in Oozyten aus Tertiärfollikeln besonders gering. Mithilfe spezifischer Primer und der RT PCR konnte ZP-mRNA in isolierten Oozyten und Follikelzellen des Marmoset Affen nachgewiesen werden. Die quantitative Bestimmung von ZPB-, ZPA- und ZPC-mRNA-Transkripten in Marmoset Oozyten erfolgte mittels real-time PCR. Die Oozyten wurden nach dem Reifestadium (Oozyten aus Follikeln mit einem Durchmesser von <600µm, von 600-1000µm und >1000µm, die periantralen, kleinen und großen antralen Follikel entsprechen) klassifiziert. Bestimmt wurde sowohl die absoluten Kopienzahl der ZP-Transkripte sowie des housekeeping Gens GAPDH, als auch die relative Expression von ZPB, ZPA und ZPC. Es zeigte sich ein Unterschied in der Menge der ZP-Expression in Bezug auf die einzelnen Follikelgrößen. Im Vergleich wurde die größten Differenzen aller drei ZP-Transkripte zwischen den Oozyten aus Follikeln der Größe 600-1000µm (geringste Menge an Transkripten) und Follikeln der Größe <600µm (größte Menge an Transkripten) festgestellt. Im Verlauf der Follikulogenese kam es zu einer Abnahme der Transkription aller ZP-Glykoproteine der Oozyte. Mit Ausnahme von ZPC war dieser Unterschied beim Vergleich von Oozyten aus großen antralen Follikeln (>1000µm) mit den Oozyten aus periantralen Follikeln (<600µm) weniger deutlich ausgeprägt. Abschließend wurde die real-time PCR für kleinste Mengen an Untersuchungsmaterial optimiert. Es gelang der Nachweis von ZP-Transkripten in einem Bruchteil der aus einer Oozyte isolierten totalRNA (ZPB 1:100, ZPC 1:10). Die hier vorgestellten Untersuchungen dienen zum einem dem besseren Verständnis bezüglich Lokalisation, Verteilung und Synthese der ZP-Proteine in Marmoset Oozyten und bilden zum anderen die Basis für weitere Versuche mit in vitro kultivierten Marmoset Oozyten. Die Ergebnisse liefern möglicherweise grundlegende Erkenntnisse zur Optimierung der in vitro Follikelreifung im humanen System und könnten somit in der klinischen Diagnostik Anwendung finden. In this thesis the localisation of the ZP-glycoproteins and their de novo synthesis in marmoset ovary cells was studied by means of in situ hybridisation with several specific riboprobes for the three ZP-glycoprotein mRNAs. After synthesizing the riboprobes with complementary sequences against various regions of the respective ZP-mRNA, their application was optimized for hybridisation on formalin fixed tissue sections of marmoset ovaries. The results show that clear signals from all riboprobes could be detected in the cytoplasm of marmoset monkey follicle cells. Signals were found as well in oocytes, however not constantly, and even more rarely in oocytes of larger follicles. Respective negative controls did not display any non-specific signals. Alternatively, ZP-glycoprotein mRNA could be detected in marmoset follicle cells by applying RT-PCR experiments. Subsequently, the quantitative expression of ZPA-, ZPB- and ZPC-mRNA transcripts in three different categories of marmoset monkey oocytes was determined. Oocytes were isolated and classified by the diameter and stage of maturity of the follicles they derived from. In particular, expression of ZP-mRNA in oocytes from periantral follicles with a diameter of <600µm, oocytes from small antral follicles with a diameter of 600-1000µm and large antral follicles with >1000µm of diameter was studied. For quantification of ZP-glycoprotein transcripts the real-time PCR method was used. The determination of the absolute transcript copy numbers of ZP-transcripts including the housekeeping gene GAPDH was performed, as well as the determination of the relative ZP-mRNA expression in the three above mentioned oocyte categories. A distinct difference in the amount of transcripts of the three ZP-glycoproteins in oocytes could be found within the different follicle sizes. The largest amount of transcripts was determined in oocytes from periantral follicles (<600µm), while the most distinct decline of ZP-mRNA transcription was found in oocytes from small antral follicles (600-1000µm). Relative comparison of ZP-mRNA expression in oocytes from periantral follicles (<600µm) with oocytes from small antral follicles (600-1000µm) showed the most particular decrease of transcription of ZPA-, ZPB- and ZPC-glycoproteins in small antral follicles. With exception for ZPC this difference was not obvious by comparing large antral follicles (>1000µm) with periantral follicles (<600µm). A slight up regulation of ZP-protein transcription towards the end of folliculogenesis could be found particularly for ZPA and ZPC. Finally, quantitative real-time PCR for ZP-mRNA was optimized to detect very low amounts of ZP-mRNA in specimen. It could be demonstrated that the method was sensitive enough to amplify templates from fractional amounts of a single marmoset oocyte, even when total mRNA from one oocyte was diluted (e.g. up to a factor of 100 for ZPB). In conclusion, the data obtained in this thesis provide a better understanding of localization, distribution and synthesis of ZP-glycoproteins in the marmoset monkey. The results might be used as reference values for further ZP-mRNA quantification studies with in vitro maturated marmoset oocytes. Furthermore, the results and techniques that were established could be the basis for further studies regarding the human and animal reproductive system leading to important new information needed for successful in vitro maturation of follicles in assisted reproduction.