Einfluß von NO/cGMP-abhängiger Induktion des pro-apoptotischen Signaltransduktionsweges auf das Kontraktionsverhalten ventrikulärer Herzmuskelzellen

Abstract

Der O2-messende Mechanismus chemosensitiver Paraganglien von Säugetieren ist nach wie vor nicht vollständig aufgeklärt. Als Modell für Studien am O2-messenden Mechanismus Hypoxie-sensitiver Paraganglien dienten PC12-Zellen, da sie eine sehr hohe Sensitivität gegenüber O2-Schwankungen aufweisen. In Versuchen an PC12-Zellen konnte unter Hypoxie ein intrazellulärer Anstieg von ROS beobachtet werden. In den bisherigen Arbeiten wurde bisher jedoch noch nicht untersucht, welche ROS genau gebildet werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu ermitteln, welche ROS unter Hypoxie in PC12-Zellen der Ratte gebildet werden, ebenfalls wurde die Spezifität des Fluoreszenz-indikators H2R für die ROS-Untersuchung untersucht. Zur genaueren Differenzierung der ROS wurden verschiedene Radikalfänger und Inhibitoren der ROS-Bildung eingesetzt. Die PC12-Zellen wurden in Gegenwart von H2R unter Normoxie und Hypoxie inkubiert. Durch intrazellulär gebildete ROS wird die farblose Substanz zu ihrem fluoreszierenden Metaboliten Rhodamin 123 oxidiert. Mittels Laser Scan Mikroskop konnte die Fluoreszenzintensität des Indikators gemessen werden. In 35 Messungen ohne Inhibitor- oder Radikalfängerzusatz konnte ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität unter hypoxischen Bedingungen beobachtet werden. Um herauszufinden, ob extrazelluläres H2O2 bei der H2R-Oxidation beteiligt ist, wurde Katalase eingesetzt. Die Messergebnisse von mit Katalase-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollen wiesen nach Inkubation unter normoxischen und hypoxischen Konditionen keinen signifikanten Unterschied auf. Cysteamin wurde als intrazellulärer H2O2-Fänger eingesetzt. Die Messergebnisse von Cysteamin-behandelten Zellen und Kontrollen wiesen nach Inkubation unter Normoxie keinen signifikanten Unterschied auf, jedoch konnte unter hypoxischen Bedingungen ein signifikant geringerer Fluoreszenzanstieg in Cysteamin-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt werden. Phenanthrolin wurde als Eisenchelator eingesetzt. Im Vergleich zu Kontrollen wiesen Phenanthrolin-behandelte Zellen nach Inkubation unter normoxischen und hypoxischen Konditionen keinen signifikanten Unterschied in der Rhodamin 123-Fluoreszenzintensität auf. Dimethylharnstoff wurde als Hydroxylradikal-Fänger eingesetzt. Auch die Mess-ergebnisse von Dimethylharnstoff-behandelten Zellen und Kontrollen wiesen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie keine signifikanten Unterschiede auf. Um zu überprüfen, in wie weit NO˙ oder ONOO- in diesem Versuchsaufbau bei der H2R-Umwandlung eine Rolle spielen, wurden Versuche mit Ebselen (Antioxidanz, welches an Peroxynitrit bindet) und N-G-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA, NO-Synthasehemmer) durchgeführt. Sowohl die Messergebnisse an Ebselen-behandelten PC12-Zellen als auch die an L-NMMA-behandelten Zellen wiesen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf. Nitroblautetrazolium (NBT) wurde schließlich als intrazellulärer O2.--Fänger eingesetzt. Die Messergebnisse von NBT-behandelten Zellen wiesen im Vergleich zu Kontrollen nach Inkubation unter Normoxie und Hypoxie signifikant geringere Werte auf. In NBT-behandelten Zellen führte Hypoxie nicht mehr zu einem siginifikanten Anstieg der Indikatorfluoreszenz.