Charakterisierung des Glykosylierungsmusters des murinen, neuralen Zelladhäsionsmoleküles CD24

Abstract

Das Zelladhäsionsmolekül CD24, das auch Nectadrin oder Heat Stable Antigen (HSA) genannt wird, ist über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) in den Mikrodomänen der Zellmembran verankert. Es wird auf haematopoetischen, neuralen und Tumorzellen exprimiert und hat wichtige Funktionen im Immunsystem, im Nervengewebe und bei der Onkogenese bzw. Metastatisierung. Außerdem scheint es bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen, wie Multipler Sklerose, eine Rolle zu spielen. Die murine Form von CD24 ist aus nur 27 Aminosäuren aufgebaut; wovon nahezu die Hälfte Serin, Threonin und Asparagin-Reste sind, die potentielle N- und O-Glykosylierungspositionen darstellen. Abhängig vom Zelltyp und seinem Entwicklungsstadium variiert das Molekulargewicht von CD24 von 27-70 kDa, was auf Unterschiede in der Glykosylierung zurückzuführen ist. Die mannigfaltigen Funktionen von CD24 scheinen daher hauptsächlich, wenn nicht gar vollständig, von den Glykanen vermittelt zu werden.Das Ziel der vorliegenden Studie war die Anfertigung einer detaillierten Strukturanalyse der N- und O-Glykane von CD24. Zur Charakterisierung der unterschiedlichen Kohlenhydratspezies wurde CD24 aus Hirnen von 1-10 Tage alten Mäusen mittels Immunaffinitätschromatographie isoliert und aufgereinigt. Nach Proteasebehandlung mit dem Enzym O-Sialoglykoprotein Endopeptidase wurden die N-Glykane des Moleküls enzymatisch mit N-Glykosidase F (PNGaseF) freigesetzt. Die O-Glykane auf den verbleibenden Peptiden wurden chemisch durch reduktive beta-Eliminierung erhalten. Es folgte die Analyse der nativen, pyridylaminierten und/oder reduzierten, permethylierten N- bzw. O-Glykangemische mittels Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS/MS) und Electrospray Ion Trap Massenspektrometrie (ESI-IT-MSn). Die dabei gewonnenen Strukturinformationen wurden durch Durchführung einer Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) unterstützten Verknüpfungsanalyse anhand partiell methylierter Alditolacetate untermauert.Die Glykomanalyse von neuralem CD24 der Maus zeigte eine große Heterogenität an Glykanstrukturen. Bei den N-Glykanen konnten ca. 60 verschiedene Kohlenhydratkompositionen, vor allem Oligosaccharide vom komplexen Typ, nachgewiesen werden, die zum Teil Kernfucosen, LewisX Epitope, Blutgruppen H-Antigene, Bisecting N-Acetylglukosamin und N-Acetyllactosamin-Wiederholungseinheiten tragen. In geringerer Konzentration konnten zudem oligomannosidische und hybride N-Glykane detektiert werden. Bei den O-Glykanen konnten mit ungefähr 30 verschiedenen Monosaccharidzusammensetzungen eine große Vielfalt an Mucin-Typ- und O-Mannosyl-Glykanen charakterisiert werden, die teilweise funktionell relevante Kohlenhydratepitope, wie alpha-2,3 verknüpfte Sialinsäure, LewisX und Sialyl-LewisX, Disialyleinheiten, N-Glycolylneuraminsäure und in geringen Konzentrationen auch das HNK-1 Epitop tragen.Die gewonnenen Strukturinformationen zur Glykosylierung des neuralen CD24 der Maus bilden nun die Grundlage für das Auffinden weiterer Interaktionspartner und das Verstehen der biologischen Funktionen des Moleküls im Nervengewebe. The cell adhesion molecule CD24, also called nectadrin or heat stable antigen (HSA), is anchored by glycosylphosphatidylinositol (GPI) to lipid rafts within the cell membrane. CD24 is abundantly expressed on a variety of cell types including haematopoietic, neural and tumour cells and plays therefore important roles in the central nervous system, the immune system, in the development of cancer. Recently, it has attracted considerable attention due to its implications in autoimmune diseases, such as multiple sclerosis. The murine neural form of CD24 has a peptide core of only 27 amino acids. Nearly half of the amino acids represent Serin, Threonin and Asparagine residues that are potential sites for O- and N-glycosylation. Depending on the cell type and the developmental stage CD24 has an apparent molecular weight ranging between 27 and 70 kDa due to differences in glycosylation. Therefore, it has been proposed that functions of CD24 are mainly or exclusively mediated by its glycans. The aim of the present study was a detailed structural analysis of the N- and O-linked glycans. To characterize the carbohydrate structures we have purified CD24 from 1-10 day old mouse brains by immunoaffinity chromatography. After treatment with O-sialoglycoprotein endopeptidase N-glycans were released by N-Glycosidase F (PNGaseF). O-glycans were liberated from the remaining peptide cores by reductive beta-elimination. Resulting carbohydrate species were analyzed by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS) and Electrospray Ion Trap mass spectrometry (ESI-IT-MSn)) in their native, pyridylaminated and/or reduced, permethylated form without prior chromatographic separation. The drawn structural conclusions were corroborated by gas-liquid chromatography (GC)/MS linkage data of the partially methylated alditol acetates.The results of this glycomics approach revealed a heterogeneous pattern of approximately 60 different N-glycan compositions, primarily complex-type N-glycans carrying, in part, core-linked fucose, LewisX-determinants, blood group H-antigen, bisecting N-acetylglucosamine and N-acetyllactosamine repeating units in addition to small amounts of high-mannose-type and hybrid-type N-glycans. The corresponding O-glycans are similary characterized by a high diversity about 30 different monosaccharide compositions. We could detect several mucin-type- and O-mannosyl-glycans, carrying, in part, carbohydrate epitopes of functional relevance like alpha-2,3-linked sialic acid, LewisX and sialyl-LewisX, N-glycolyl-neuraminic acid and disialyl units. Furthermore, the HNK-1 epitope could be also detected in minor quantities.The obtained structural data of the CD24 glycans may provide the basis for identification of new interaction partners of CD24 and a better understanding of the functional roles of this molecule in the nervous system.