Multiplex Polymerasekettenreaktion mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion durch den Einsatz von Primern mit "primerintegrierten Reportersequenzen"

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, mit Hilfe von Primern mit integrierten Reportersequenzen (PIRS) Gruppen unterschiedlicher Zielsequenzen in einem Realtime-PCR-Ansatz zu differenzieren. In einer Multiplex-Realtime-PCR wird dieses Verfahren angewandt, um bei Leukämien des Kindesalters jeweils zwei chromosomale Translokationen mit guter und zwei chromosomalen Translokationen mit schlechter Prognose in einem einzigen Reaktionsansatz direkt während der laufenden PCR zu detektieren. Zur Durchführung der Realtime-PCR wird der ABI-PRISMTM 7700 Sequence Detector der Firma Applied Biosystems verwendet. Based on Realtime-PCR with the ABI-PRISMTM 7700 Sequence Detector a new technique was developed in order to increase the number of target sequences which can be detected in a single PCR. Different to the usual Taq-ManTM-Realtime-PCR the target sites for fluorescent probes were not located within the target sequences itself but integrated into the PCR-Primers, designated as primer-integrated-reporter-sequences (PIRS) . By using this technique it was possible to detect four different chromosomal translocations frequently found in childhood leukaemia, two of them associated with a poor prognosis and the other ones corresponding to a poor prognosis.