Transcriptional profile of the mononuclear phagocyte system in the lungs

Abstract

Peripheral blood monocytes (PBMo) originate from the bone marrow, circulate in the blood, and emigrate into various organs where PBMo differentiate into tissue resident cellular phenotypes of the mononuclear phagocyte system (MPS), including macrophages (MQ) and dendritic cells (DC). As in other organs, this emigration and differentiation process is essential to replenish the mononuclear phagocyte pool in the lung under both inflammatory and non-inflammatory steady-state conditions. While many studies have addressed inflammation-driven monocyte trafficking to the lung, the emigration and pulmonary differentiation of PBMo under non-inflammatory conditions is comparatively poorly understood. In order to assess the transcriptional profile of circulating and lung-resident MPS phenotypes, PBMo, lung MQ and lung DC from naïve mice were flow-sorted to high purity, and cellular gene expression was compared by DNA microarray on a genome wide scale. Differential regulation of selected genes was validated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and at the protein level by flow cytometry. Differentially-expressed genes related to cell trafficking were selected and grouped into three clusters: (i) matrix metallopeptidases, (ii) chemokines/chemokine receptors, and (iii) integrins. Expression profiles of gene clusters were further examined at the mRNA and protein levels in subsets of circulating PBMo (GR1- versus GR1+) and lung MQ (alveolar MQ versus interstitial MQ). These data identify differentially activated genetic programs in circulating monocytes and their lung descendents. Lung DC activate an extremely diverse set of genes, but largely preserve a mobile cell profile with high expression levels of integrins, chemokines and chemokine receptors. In contrast, interstitial and alveolar MQ, downregulate gene expression of these traffic-relevant communication molecules, but strongly upregulate a distinct set of matrix metalloproteinases potentially involved in tissue invasion and remodeling. In addition, in this study, the first evidence for functional expression of 5-HT2C receptors on resident alveolar MQ (rAMQ;) is provided. The inventory of 5-HT type 2 receptors in mouse lung MQ and alveolar epithelial cells (AEC) was investigated by qPCR, which revealed the expression of receptor subunits 5-HT2A and 5-HT2B on AEC and 5-HT2C on rAMQ. Upon 5-HT stimulation, freshly isolated rAMQ increased expression of CCL2 mRNA as assessed by qPCR. Moreover, rAMQ stimulated with 5-HT augmented production of CCL2 protein as indicated by dot-blot assay and enzyme-linked immunosorbent assay. In rAMQ isolated from 5HT2C-deficient mice, CCL2 production at both the mRNA and protein level was not affected by 5-HT stimulation. The response of rAMQ to 5-HT was also assessed at the whole mouse genome level, by microarray. Genes that were identified by microarray as being regulated were involved in cytokine activity, signal transduction, biosynthetic processes or cell differentiation. Taken together, these data demonstrate the presence of functional 5-HT2C receptors on rAMQ and identify 5-HT as a novel modulator of rAMQ function.Collectively, these data provide new insight into the changes of the genetic profiles of PBMo and their lung descendents, namely DC and MQ under non-inflammatory, steady-state conditions. Genes involved in cell trafficking expressed on DC were validated at the protein level, while expression of the 5-HT2C receptor in rAMQ was investigated for its functionality. These findings will help to better understand the complex relations within the mononuclear phagocyte pool of the lung. Periphere Blut Monozyten (PBMo) entstammen dem Knochenmark, sie zirkulieren im Blut und können in verschiedene Organe einwandern, wobei sich PBMo im Gewebe zu Zellen des Mononukleären Systems (MPS), wie Makrophagen (MQ) und dendritische Zellen (DC) differenzieren.Wie in anderen Organen ist der Prozess des Auswanderns und Differenzierens von PBMo auch in der Lunge notwendig, um die Funktion des pulmonalen Monozyten-Makrophagen Systems unter entzündlichen und nicht-entzündlichen Bedingungen zu gewährleisten. Während sich viele Studien der Entzündungs-gerichteten Monozyten-Einwanderung in die Lunge gewidmet haben, ist über die Migration und pulmonale Weiterentwicklung von PBMo unter nicht-entzündlichen Bedingungen vergleichsweise wenig bekannt.Um das Transkriptionsprofil von zirkulierenden und in der Lunge residenten Zellen des MPS zu untersuchen, wurden PBMo, Lungen-MQ und Lungen-DC von gesunden Mäusen mittels Durchflusszytometrie hochrein sortiert und ihre zelluläre Genexpression durch DNA-Microarray in einem Genom-weiten Maßstab verglichen. Unterschiedlich expremierte Gene wurden durch quantitative Polymerase-Ketten-Reaktion (qPCR) und auf Protein-Ebene mittels Durchflusszytometrie bestätigt.Differenziell regulierte Gene, die im Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden ausgewählt und in drei Gruppen unterteilt: (i) Matrix Metalloproteinasen, (ii) Chemokine / Chemokin-Rezeptoren, und (iii) Integrine. Expressionsprofile dieser Gen-Cluster wurden in Subpopulationen von zirkulierenden PBMo (GR1- versus GR1+) und Lungen MQ (alveoläre MQ versus interstitielle MQ) auf mRNA und Proteine weiter untersucht. Diese Daten zeigten, dass in zirkulierenden Monozyten und ihren residenten Nachkommen in der Lunge unterschiedliche genetische Programme aktiviert werden. Pulmonale DC aktivieren eine äußerst heterogene Gruppe von Genen, erhalten jedoch weitgehend ein mobiles Zellprofil mit hoher Expression von Integrinen, Chemokinen und Chemokin-Rezeptoren. Im Gegensatz dazu regulieren interstitielle und alveoläre MQ die Genexpression von Zellmigrations-relevanten Molekülen herunter, aktivieren hingegen die Genexpression einer bestimmten Gruppe von Matrix Metalloproteinasen, die möglicherweise am Prozess des Gewebeumbaus und der Zellinvasion beteiligt sind. Desweiteren wurde in dieser Studie der erste Beleg für die funktionelle Expression von 5-HT2C Rezeptoren auf residenten alveolären MQ (rAMQ) erbracht. Die 5-HT Typ 2 Rezeptoren in MQ und Alveolarepithelzellen (AEC) der Mauslunge wurden mittels qPCR untersucht, die die Expression von den Rezeptor-Untereinheiten 5-HT2A und 5-HT2B auf AEC-und von 5-HT2C auf rAMQ ergab. Frisch isolierte rAMQ stimuliert mit 5-HT, erhöhten die Expression von CCL2 mRNA und die Produktion des CCL2 Proteins, gezeigt durch qPCR, Dot-Blot und Enzyme Linked Immunosorbent Assay. In rAMQ von 5HT2C-defizienten Mäusen wurde die CCL2 Produktion sowohl auf mRNA als auch auf Protein-Ebene durch 5-HT-Stimulation nicht gesteigert. Die transkriptionelle Reaktion von rAMQ auf 5-HT wurde zusätzlich auf der Ebene des kompletten Mausgenoms mittels Microarray geprüft. Nach 5-HT Behandlung differenziell regulierte Gene, die mittels Microarray identifiziert wurden, sind an Zytokin-Aktivität, Signaltransduktion, Biosynthese-Prozessen und Zelldifferenzierung beteiligt. Diese Daten zeigen das Vorhandensein von funktionellen 5-HT2C Rezeptoren auf rAMQ und identifizieren 5-HT als neuartigen Modulator der Funktion von rAMQ. Zusammengenommen bieten diese Daten neue Einblicke in die Veränderungen der genetischen Profile von PBMo und ihrer residenten Nachkommen (DC und MQ) in der Lunge unter nicht-entzündlichen Bedingungen. Gene, die in die Zellmigration von DC involviert sind, wurden auf Protein-Ebene bestätigt, während für den 5-HT2C Rezeptor auf rAMQ gezeigt wurde, dass dieser funktionell aktiv ist und die zelluläre Antwort auf 5-HT vermittelt. Diese Ergebnisse werden dazu beitragen die komplexen Beziehungen innerhalb des Monozyten-Makrophagen-Pools in der Lunge besser zu verstehen.