Wirkung von Transaminaseinhibitoren auf die Tryptophan-abhängige Pigmentbildung von Malassezia furfur

Abstract

Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von Transaminaseinhibitoren auf die Pigmentbildung von Malassezia furfur. Das Phänomen der Pigmentbildung von Malassezia furfur durch Verstoffwechselung der Aminosäure Tryptophan, wenn diese als alleinige Stickstoffquelle vorhanden ist, wurde 1998 erstmalig beschrieben (Mayser 1998). Diese Pigmente können verschiedene klinische Ausprägungen der Pityriasis versicolor verursachen, die eine häufige Malassezia assoziierte Erkrankung darstellt. Als Grundlagen dieser Arbeit dienten die Untersuchungen an dem verwandten Organismus Ustilago maydis, die gezeigt haben, dass zur Biosynthese dieser Vielzahl von komplexen Indolderivate aus Tryptophan nur ein einziger enzymatisch katalysierter Schritt notwendig ist (Zuther et al., 2008). Dieser Schritt, die Desaminierung von Tryptophan zu Indolpyruvat, wird in Ustilago maydis von der Tryptophan-Aminotransferase TAM 1 katalysiert. Dies zeigt, dass die TAM 1 für die tryptophanabhängige Pigmentbildung verantwortlich ist. Ein ähnliches Enzym wurde auch in Malassezia-Hefen gefunden. Die Überlegung bei dieser Arbeit war nun, ob durch den Einsatz eines Tryptophan-Aminotransferase-Inhibitors die Pigmentbildung von Malassezia furfur unterbunden werden kann. In einer ersten Untersuchung wurden die verschiedensten Transaminase-Inhibitoren auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Aktivität der TAM 1 zu unterdrücken. In einem Agardiffusionstest auf Pigmentinduktionsagar mit Tryptophan als alleiniger Stickstoffquelle wurden vier Substanzen gefunden, die die Pigmentbildung vollständig unterdrückten. Diese vier Substanzen sind 100 Aminooxyacetat, Cycloserin, Terizidon (ein Kondensationsprodukt von Cycloserin) und Homoserin. Bei identischen Testreihen, durchgeführt auf modifiziertem Dixon Agar (einem Agar mit mehreren Stickstoffquellen), konnte keine Wachstumshemmung des Pilzes beobachtet werden. Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass die Substanzen nicht antimyzetisch wirken und den Pilz abtöten, sondern nur spezifisch die TAM 1 hemmen. In einem Plattenverdünnungstest mit einer linearen Verdünnungsreihe konnte die Hemmwirkung quantitativ näher umgrenzt werden. Aminooxyacetat erwies sich in dem gewählten Versuchsansatz als stärkster Hemmstoff, der schon ab einer Konzentration von etwa 15 mM in chemisch reinem Wasser vollständig die Pigmentbildung hemmt. Cycloserin und Terizidon erwiesen sich ebenfalls als sehr gute Hemmstoffe, mit einer Konzentration von 125 mM (Cycloserin) bzw. 30 mM (Terizidon). Bei Homoserin war festzustellen, dass es sich bei diesem Stoff vermutlich um einen reversibel kompetitiv wirksamen Hemmstoff handelt. Das bedeutet, die Hemmung ist nicht stabil, bei einem erneuten Angebot von Tryptophan kommt es zu einer Pigmentbildung. Aus diesem Grunde wurden die Versuche mit Homoserin nicht weitergeführt. In einer off-label Anwendung wurden nach erfolgter Aufklärung, in Absprache mit der Ethikkommission und schriftlichem Einverständnis, Patienten mit Pityriasis versicolor mit einer steril-filtrierten, wässrigen, auf pH 7 gepufferten D-Cycloserinlösung (0,2 M) behandelt. Jeder Patient erhielt 50 ml dieser Lösung zur zweimal täglichen Anwendung über 5 Tage im Bereich der Läsionen. Bei den Patienten mit hyperpigmentierter, im Nativpräparat positiver PV heilten die Veränderungen vollständig innerhalb von 3 - 5 Tagen ab. Bei den Patienten mit einer PV alba setzte keine Besserung ein. Die Ergebnisse zeigen deutlich das therapeutische Potenzial einer Hemmung der TAM 1 zur Therapie und Prophylaxe der PV und geben zudem Einblicke in 101 die mögliche Pathophysiologie dieser häufigen Erkrankung. Zum ersten Mal konnte damit gezeigt werden, dass topische Transaminaseinhibitoren wie Cycloserin einen raschen und positiven Effekt auf das klinische Erscheinungsbild der PV haben können. Denkbar als ein neuer therapeutischer Ansatz für die Therapie und Prophylaxe der PV wäre die topische Anwendung des Präparates z. B. in Form eines Shampoos, das vorbeugend täglich von diesen Patienten anzuwenden ist, um ein Rezidiv zu verhindern und der Depigmentierung vorzubeugen. Dies eröffnet möglicherweise einen spezifischeren Ansatz für die Prophylaxe und Therapie der PV als eine herkömmliche antimykotische Therapie. The aim of the current study was to investigate the effectiveness of transaminase inhibitors in preventing pigmentation of Malassezia furfur. For the first time Mayser 1998, described that Tryptophan metabolized by Malassezia furfur lead to pigmentation, when present as a sole nitrogen source (Mayser 1998). These pigments could result in various clinical expressions of Pityriasis versicolor, which represents a common Malassezia associated disease. This study is based on investigations of the phylogenetical closely related organism Ustilago maydis. Recently Zuther et al. showed that the biosynthetic pathway leading to complex indol-derived pigment production from tryptophan is catalyzed by a single enzyme called TAM 1 (Zuther et al., 2008). TAM 1 is a Tryptophan-aminotransferase, converting tryptophan to Indolpyruvate, thus playing a key role in tryptophan induced pigmentation. A similar enzyme was found in Malassezia species. The hypothesis of this study was that by using a tryptophan-aminotransferase-inhibitor, pigment formation of Malassezia furfur can be suppressed. In a first investigation with an agar diffusion method based on pigment-inducing agar and tryptophan as a sole nitrogen source, four compounds completely inhibiting pigmentation were discovered: Aminooxyacetate, Cycloserine, Terizidon (a condensate of Cycloserine) and Homoserine. The confirmation that the alleged anti pigmentation effect is based on the specific inhibition of TAM 1 and not on a possible antimycotic activity was performed with modified Dixon agar. This medium with a broad spectrum of nitrogen 103 sources showed no growth inhibition in the otherwise identically performed experiment. A linear agar dilution test helped to quantify the inhibition effect. Aminooxyacetat was found to be the strongest inhibitor, capable of inhibiting the pigment formation completely at a concentration of approximately 15 mM in chemically pure water. Cycloserine and Terizidon also proved to be very good inhibitors at concentrations of 125 mM (Cycloserine) and 30 mM (Terizidon). It was however determined that Homoserine serves as a reversible competitive inhibitor with unstable inhibition, implying that after additional supply of tryptophan, pigment formation would occur. Based on this finding, the investigations with Homoserine were discontinued. In agreement with the local ethical committee and after informed written consent, an off-label use was performed with patients suffering from PV. PV was treated with a sterile-filtered, buffered aqueous solution containing D-Cycloserine (0,2 M). After informed consent each subject received 50 ml of the solution to be applied to the lesions twice daily for five days. In patients with proven hyperpigmented PV-lesions, lesions were completely cured after 3-5 days. On the other hand, no effects were evident in patients with PV alba. The results of the current study point at the therapeutic potential of TAM 1 inhibition for the treatment and prophylaxis of PV and also adds to the understanding of the possible pathophysiology of this frequent disease. For the first time, an imposing effect of a topically applied transaminase inhibitor on the clinical course of Pityriasis versicolor could be demonstrated. The topical application of transaminase inhibitors could prove itself as a new therapeutic approach for the treatment and prophylaxis of Pityriasis versicolor on daily bases e.g. as shampoo, preventing the recurrence and depigmentation. Our results also underline the importance of the tryptophan-derived metabolic pathway in the pathogenesis of Pityriasis versicolor. This could help to develop a new therapeutic approach in the therapy and prophylaxis of Pityriasis versicolor, based on a completely different and more specific approach in treatment than the commonly applied antimycotic therapy.