Untersuchungen zur Gentoxizität von Acrylamid in Abhängigkeit von der Cytochrom P450 2E1 Aktivität in humanen Hepatomzellen

Abstract

Acrylamid ist eine von der IARC als möglicherweise karzinogen eingestufte Substanz, welche vor allem über Zigarettenrauch und kohlenhydratreiche Nahrungsmittel vom Menschen aufgenommen wird.In der vorliegenden Arbeit wurde die Gentoxizität von Acrylamid in HepG2-Zellen mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (Cometassay) untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss von Ethanol, welches Cytochrom P 450 2E1 induziert, auf die durch Acrylamid hervorgerufene DNA-Migration betrachtet. Acrylamidkonzentrationen von 1,25 mM bis 10 mM induzierten eine konzentrationsabhängige DNA-Migration (OTM) in HepG2-Zellen. Die Exposition mit 10 mM Acrylamid führte zu einem 8-fachen Anstieg der DNA-Schädigung verglichen mit der Negativkontrolle. Für die Kombination von Ethanol und Acrylamid wurden die Hepatomzellen mit Ethanol für 24 Stunden inkubiert und anschließend mit 5 mM Acrylamid für weitere 24 Stunden exponiert. Eine Inkubation mit 120 mM Ethanol und 5 mM Acrylamid verstärkte die DNA-Migration um mehr als das doppelte in Bezug zur Referenzkontrolle 5 mM Acrylamid. Für die Klärung der zugrundeliegenden Mechanismen wurde die Modulation der Cytochrom P 450 2E1 Aktivität und die Depletion von Glutathion in derselben Zelllinie erforscht. Im Westernblot zeigte sich ein ethanolinduzierter Anstieg des Enzyms Cytochrom P450 2E1, dem eine wichtige Rolle in der Metabolisierung und damit Toxifizierung von Acrylamid zukommt. Es zeigte sich zusätzlich, dass die intrazelluläre Glutathionkonzentration durch Ethanol- oder Acrylamidexposition signifikant gesenkt wurde. In den Kombinationsexperimenten mit Ethanol und Acrylamid konnte ein überadditiver Effekt der einzelnen Testsubstanzen in der GSH-Depletion beobachtet werden. Bei im Cometassay beobachteter Abnahme der Zellvitalität konnte eine apoptotische Ursache mit Hilfe eines Apoptose-Tests ausgeschlossen werden. Daher lässt sich die Vitalitätsabnahme bei steigender Konzentration der beiden Testkomponenten auf nekrotische Effekte zurückführen. Die erhobenen Daten zeigen ein deutlich erhöhtes gentoxisches Potenzial der Kombination von Acrylamid mit Ethanol, verglichen mit alleiniger Acrylamidexposition. In der Zusammenschau der Ergebnisse erklären sowohl die ethanolvermittelte Induktion des Enzyms Cytochrom P450 2E1 als auch die Depletion des Glutathionspiegels den überadditiven Effekt von Ethanol und Acrylamid. Die Acrylamidkonzentrationen in dieser Arbeit zeigten erst in sehr hohen Konzentrationen, ab 2,5 mM, einen Effekt. Eine solche Konzentration ist über die Ernährung nicht zu erreichen. Dennoch sollten die Konsequenzen einer Kombination aus acrylamidhaltigen Nahrungsmitteln und Alkoholgenuss auf den Menschen kritisch diskutiert werden. Acrylamide is an agent which is classified by the IARC as probably being carcinogenic to humans. Carbohydrate-rich food and cigarette smoke present the main exposure sources for the general public.In the analysis at hand, the genotoxicity of acrylamide in HepG2-cells was examined. For this purpose the Commetassay was used. In addition to that, the impact of ethanol on the modulation of the cytochrome P 450 2E1 activity and, therefore, of the DNA-migration induced by acrylamide was analysed. Furthermore, the depletion of glutathione in the same cell line was examined.For the combination of ethanol and acrylamide the hepatocytes were incubated with ethanol for 24 hours and afterwards exposed with 5 mM acrylamide for yet another 24 hours. Concentrations of acrylamide between 1,25 mM and 10 mM induced DNA-migration (OTM) in HepG2-cells dependent on concentration. The exposition with 10 mM acrylamide led to an octuple rise of the DNA impairment compared to negative control. An incubation with 120 mM ethanol and 5 mM acrylamide led to an increase of the DNA-migration which was twice as much as the reference value of 5 mM acrylamide. Due to ethanol the immunoblot showed an explicit rise of the enzyme cytochrome P450, which plays an important role in the process of metabolism and toxification of acrylamide. In addition to that, the intracellular concentration of glutathione could be significantly reduced by the exposition of ethanole and acrylamide. In the combination experiment with ethanol and acrylamide an ancillary effect of the individual test substances in the GSH-depletion could be observed. Using ssDNS-tests, apoptosis could not be identified and was thus ruled out. Therefore, the detected decrease of cell activity along with the rise of the concentration of both test components at the same time cannot be ascribed to necrotic effects. The collected data showed a strikingly increased genotoxic Potenzial in the case of the combination of acrylamid and ethanol compared to the sole exposition of acrylamide.In summary, both the induction interfered by ethanol of the enzyme cytochrome P450 2E1 and the depletion of the level glutathione explain the high additive effect of ethanol and acrylamid.In the analysis at hand, relatively high concentrations of acrylamide were used. Usually such concentrations are not found in common nutrition. Nevertheless the consumption of alcohol in combination with nutrition which contains is to be critically looked at and to be discussed.