Funktionelle Charakterisierung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren an thorakalen und lumbalen, isolierten primärkultivierten Spinalganglienneuronen adulter Ratten

Abstract

Eine wichtige Modalität, die inhomogene Populationen pseudounipolarer sensibler Neurone über Adelta- und C-Fasern in das Hinterhorn des Rückenmarks übermitteln, ist die Schmerzwahrnehmung. Hierbei sind in der Zellmembran freier, peripherer Nervenendigungen lokalisierte Liganden-gesteuerte, nicht-selektive Kationenkanäle involviert. Ein geeigneter Kandidat sind auf Capsaicin-sensitiven Neuronen und in IB4-bindenden präsynaptischen Fasern im Hinterhorn des Rückenmarks nachgewiesene neuronale nAChR. Injektionen des NOS-Inhibitors L-NAME lindern Schmerzreaktionen bei arthritiskranken Tieren. DRG-Neurone enthalten NOS, so dass sie Ca2+-vermittelt NO produzieren können. Es ergibt sich aus dieser Gesamtschau die Hypothese, dass nAChR Ca2+-vermittelt eine intrazelluläre Erhöhung des second messengers NO in DRG-Neuronen aktivieren. Hier erfolgte die funktionelle Charakterisierung nAChR und erster Schritte ihrer Signaltransduktionskette an thorakalen und lumbalen isolierten, primärkultivierten DRG-Neuronen adulter Ratten. Mit Hilfe des spezifischen Fluoreszenzindikators DAF-2DA wurde hierzu die endogene NO-Generierung an vitalen Einzelneuronen in Echtzeit detektiert. Subpopulationen thorakaler und lumbaler DRG-Neurone besitzen nAChR, deren Aktivierung rasch zu einer neuronalen NO-Generierung führt. Das nAChR-aktivierte NO-Signal ist transient und lässt sich ohne Langzeiteffekte auswaschen. Der aufgedeckte nAChR-/NO-Signalweg in DRG-Neuronen kommt quantitativ in thorakalen Zellen stärker als in lumbalen vor. Die nAChR alpha7-, alpha9/alpha10-Subtypen sind partiell bei thorakalen gleichermassen wie lumbalen DRG-Neuronen involviert. Das nAChR-aktivierte NO-Signal ist nur bei einer kleinen thorakalen Neuronensubpopulation partiell über einen Ca2+-Einstrom vermittelt. In einer kleinen Subpopulation thorakaler DRG-Neurone wird das NO-Signal über einen Ca2+-Einstrom jeweils partiell von alpha7-, alpha9/alpha10-nAChR und VOCCs des L-Typs getragen. Die nAChR-stimulierte NO-Bildung basiert in thorakalen Zellen nur partiell auf unmittelbarer Produktion durch die NOS. Die erhobenen Befunde führen zu der Schlussfolgerung, dass die NO-Generierung in DRG-Neuronen in die nAChR-Signalkaskade integriert ist. Darüber kann auf mechano-/thermozeptive sowie nozizeptive Transduktions- und Transformationsprozesse Einfluss genommen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen nAChR, VOCCs vom L-Typ und NOS als relevante periphere Zielmoleküle zur Pharmakotherapie von Schmerzen sowie zur Anästhesie auf. Nociception which is an important sensory modality, is transmitted by Adelta- and C-type fibres of inhomogenous populations of pseudounipolar sensory neurons to the dorsal horn of the spinal cord. Ligand-gated, non-selective ion channels located in the cell membrane of peripheral nerve endings are involved in initiation and modulation of pain. Neuronal nAChR are one interesting receptor population which is demonstrated on nociceptive DRG neurons. Consequently, sensory neurons, which are stimulated by nicotine, may mediate peripheral nociception via nAChR activation. Also, the NO/NOS system is localised in nociceptive neurons, involved in nociception and activated by increase in intracellular Ca2+ levels. This results in the hypothesis that nAChR activate the production of the second messenger NO in DRG neurons via intracellular [Ca2+]-increase. The present study aimed to characterize nAChR and parts of the downstream signal transduction events in thoracic and lumbar isolated primary cultured DRG neurons of adult rats. Using the NO-specific fluorescent indicator DAF-2DA, the endogenous NO generation of single vital neurons was detected in real-time. Subpopulations of thoracic and lumbar DRG neurons could be demonstrated to contain functionally active nAChR, whose activation lead to rapid and transient neuronal generation of NO. This effect was reversible. This nAChR/NO pathway is more prevalent in thoracic than lumbar sensory neurons. The nAChR alpha7-, alpha9/alpha10-subtypes are partially involved in the nAChR/NO pathway regularly in thoracic and lumbar DRG neurons, whose stimulation permit the NO generation via an intracellular rise in Ca2+-concentration. The experiments showed furthermore that the required Ca2+ to activate NOS is partly of extracellular origin, particularly in thoracic but not in lumbar cells. In a small subpopulation of thoracic neurons, the Ca2+ influx depended partially on alpha7-, alpha9/alpha10-nAChR and VOCCs of the L-type. The endogenous NO increase is based partially on immediate synthesis by NOS in thoracic cells. These leads to the conclusion that NO generation of DRG neurons is integrated in the signal cascade activated by nAChR stimulation and possibly influences mechano-/thermoreceptive and nociceptive processes of transduction and transformation. The data point to NO-dependent modulation of mechano-/thermosensitivity and nociception by activation of nAChR. The results of the present study suggest nAChR, VOCCs of the L-type and NOS as being relevant target molecules of peripheral pharmacotherapy of pain and anesthesia.