Expression des non-neuronalen cholinergen Systems in osteo-blastären Zellen der Maus und des Menschen

Abstract

Acetylcholin kommt in vielen non-neuronalen Zellen und Geweben vor und ist längst nicht mehr als reiner Neurotransmitter zu bezeichnen. In non-neuronalen Zellen beein-flusst ACh basale Zellfunktionen wie Differenzierung, Proliferation und Ausbildung von Zellkontakten. Die Bildung von ACh aus Cholin und Acetyl-CoA erfolgt durch die Enzyme ChAT und CarAT. In non-neuronalen Zellen wird die Freisetzung von ACh via OCT vermittelt, aber auch durch Exozytose mittels VAChT. ACh bindet extrazellulär an muskarinische und nikotinische ACh-Rezeptoren und wird durch die Enzyme AChE oder BChE gespalten. Nikotin bindet ebenfalls an nAChR und viele Studien belegten einen negativen Effekt von Nikotin auf den Knochenstoffwechsel, Frakturheilung und Knochenmikroarchitektur, sowie Zellproliferation und -differenzierung von Osteoblas-ten. Rauchen - also Nikotinkonsum - gilt als Risikofaktor für die Entstehung von Kno-chenerkrankungen, z.B. Osteoporose. Bislang gab es noch keine systematische Darstel-lung eines ossären cholinergen Systems. Vor diesem Hintergrund postulierten wir die Existenz eines endogenen cholinergen Systems im Knochen. Mittels RT-PCR und Im-munhistochemie wurde das cholinerge Expressionsmuster in der murinen osteoblastären Zelllinie MC3T3-E1 vor und nach osteoblastärer Differenzierung sowie in der humanen Osteosarkomzelllinie SAOS-2 bestimmt. In undifferenzierten murinen MC3T3-E1-Zellen wurde die Expression von CarAT, OCT2, BChE, AChE, M1R, M2R, M4R, alpha2, alpha3, alpha5, alpha10, beta2, und beta4 nachgewiesen. Nach Kultivierung in osteogenem Medium ex-primierten die MC3T3-E1-Zellen zusätzlich OCT1, M5R und beta3, aber nicht mehr alpha3. In humanen SAOS-2-Zellen konnten Transkripte für CarAT, OCT1, BChE, M2R, M3R, M5R, alpha3, alpha5, alpha7, alpha9, alpha10 und beta2 detektiert werden. Mittels Immunhistochemie wurde die Expression von alpha3 und alpha5 auf nativen MC3T3-E1- und SAOS-2-Zellen dargestellt. Diese Studie zeigt, dass osteoblastäre Zellen alle nötigen Komponenten für Bildung, Freisetzung, Rezeptorbindung und Abbau von ACh besitzen. Während der Osteoblas-tendifferenzierung scheinen vor allem OCT1, M5R, alpha9, beta3 und alpha3 bei den murinen Zel-len eine besondere Rolle zu spielen. Darüber hinaus stellten wir Spezies-spezifische Unterschiede im Expressionsmuster fest. Insgesamt scheint ACh ein weiterer wichtiger Regulator des Knochenstoffwechsels zu sein. Es bedarf weiterer Studien um die Bedeu-tung des ossären cholinergen Systems in vivo zu erforschen und um schließlich Thera-pieoptionen für ossäre Erkrankungen entwickeln zu können. Acetylcholine occurs in many non-neuronal cells and tissues and is no longer considered a pure neurotransmitter. In non-neuronal cells, ACh controls basic cell functions such as cell differentiation, proliferation and maintenance of cell-contacts. Synthesis of ACh out of choline and acetyl-CoA can be performed either by ChAT or CarAT. In non-neuronal cells release of ACh is mediated by OCT but also VAChT me-diates the transport into vesicles and thus the release via exocytosis. ACh binds to its muscarinic or nicotinic receptors on the cell surface. The degradation enzymes AChE and BChE both hydrolyse extracellular ACh. Also, nicotine is known to bind to nAChR and many studies have shown a negative effect of nicotine on bone metabolism, fracture healing and bone microarchitecture, as well as cell proliferation and differentiation of osteoblasts. Smoking and consuming nicotine has been shown to be a risk factor for bone diseases like osteoporosis. Until we had published our data, there had been no sys-tematic description of an osseous cholinergic system. Using this background we as-sumed the existence of an endogenous cholinergic system in bone. RT-PCR and immunofluorescence were used to characterize the cholinergic expression in murine osteoblast-like MC3T3-E1 cells before and after osteoblastic differentiation and also in human osteosarcoma SAOS-2 cells. mRNA for CarAT, OCT2, BChE, AChE, M1R, M2R, M4R, alpha2, alpha3, alpha5, alpha10, beta2, and beta4 were detected in undifferentiated murine MC3T3-E1 cells. After growing these cells in an osteogenic medium, OCT1, M5R and beta3, were additionally found but a down-regulation of alpha3 was observed. In human SAOS-2 cells, transcripts of CarAT, OCT1, BChE, M2R, M3R, M5R, alpha3, alpha5, alpha7, alpha9, alpha10 and beta2 were detected. By means of immunofluorescence alpha3 and alpha5 on native MC3T3-E1 cells and SAOS-2 cells were localised. Thus, murine osteoblast-like cells and human osteoblastic cells express all necessary components for synthesis, release, receptor binding and degradation of ACh. Certain components seem to play a particular role during osteoblastic differentiation in murine cells, especially OCT1, M5R, alpha9, beta3 and alpha3. Furthermore, interspecies differences in the cholinergic expression pattern were observed. In conclusion, ACh is obviously an important regulator of bone metabolism. Further studies are needed to better understand its role and effect in vivo and to finally develop future pharmacological therapies for bone diseases. For this, the present study fills knowledge gaps in the understanding of the osseous cholinergic system.