Bakterielle Toll/interleukin-1 Rezeptor Domäne beinhaltende Proteine und deren Einfluss auf das angeborene Immunsystem

Abstract

Thema dieser Arbeit sind Aufbau, genetische Variabilität und Funktion der bakteriellen Toll/intertleukin-1 receptor (TIR) domain containing-proteins (Tcps) von E. coli (TcpC), E. feacalis Symbioflor 1 (TcpF) und L. mesenteroides (TcpM). Anhand von in silico Analysen mit TIR Domänen BLAST von NCBI konnten in den Genomen von E. faecalis Symbioflor 1 und L. mesenteroides zwei zuvor nicht charakterisierte Gene identifiziert werden. In Anlehnung an die bereits bekannten bakteriellen Tcps wurden sie als TcpF und TcpM bezeichnet. TcpF und TcpC zeigen als Produkte von Kommensalen strukturelle Ähnlichkeit mit humanem TIR Domänen, während TcpM-TIR als Produkt eines Keimes, der in der natürlichen Umgebung auf Pflanzen zu finden ist, strukturelle Ähnlichkeit mit L6-TIR Protein der Pflanze Linum usitatissimum zeigt. Insgesamt wurden 110 HWI E. faecalis Isolate und 31 Kommensale auf TcpF untersucht und der TcpF Lokus von 68 HWI Isolaten sequenziert. TcpF ist häufiger bei HWI Isolaten (79%) als bei Kommensalen (58%) und ist mit hohen Keimzahlen assoziiert. Ein hoher Grad an SNPs sowie zwei beobachtete Mutationsereignisse durch Transposition und Inversion sprechen für fortschreitende Selektion sowie eine neuerliche Akquisition des TcpF Gens von E. faecalis. Demgegenüber zeigt die Sequenz von 20 E. coli HWI Isolaten lediglich in zwei Positionen einen SNP. Die Stimulation von RAW264.7 Makrophagen mit E. coli BL21 unter Expression von TcpC, TcpF oder TcpM zeigt eine Reduktion der IL-6 und TNF-a Antwort. Umgekehrt führt die Deletion des TcpF Gens in E. faecalis Symbioflor 1 zu einer Elevation der TNFa Antwort. Der Einfluss der bakteriellen Tcps auf den TLR Signalweg wurde in transient mit NF?B, hTLR2 und Tcp transfizierten HEK293 Zellen untersucht. TcpC, TcpF und TcpM supprimieren konzentrationsabhängig die NF?B Produktion. TcpF-TIR zeigt im BB-Loop einen hohen Grad an struktureller Übereinstimmung mit TLR1-TIR, sodass eine Interaktion von TcpF-TIR mit endogenen TLR1-TIR bindenden TIR Domänen wahrscheinlich ist. Bei TcpF und TcpM handelt es sich um neue grampositive Mitglieder der Familie bakterieller Tcps. Tcps ermöglichen Bakterien über molekulare Mimikry eine auf TIR Domänen Interaktion aufgebaute Infektabwehr zu modulieren. Aufgrund ihres antiinflammatorischen Potentials könnten bakterielle Tcps in Zukunft für die Therapie infektiöser wie auch nicht-infektiöser inflammatorischer Erkrankungen therapeutisch von Nutzen sein. Subject of this work is the structure, genetic stability and function of the bacterial Tcps of E. coli (TcpC), E. feacalis Symbioflor 1 (TcpF) und L. mesenteroides (TcpM). Based on Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain structure homology we detected two previously uncharacterized genes encoding for TIR domain containing proteins in the genome of Enterococcus faecalis and Leuconostoc mesenteroides. These genes were named TcpF and TcpM, in accordance with the previously described TcpC. TcpF and TcpC as proteins of commensals show structural similarity to human TIR domains, whereas TcpM as a protein of bacteria, whose natural habitat are plants, shows structural similarity to the plant TIR domain of L6 encoded by Linum usitatissimum. 110 UTI E. faecalis and 31 E. faecalis stool isolates were analyzed for the presence of TcpF. We found that TcpF is more frequent in UTI isolates (79%) than in stool isolates (58%) and that TcpF is associated with higher bacterial counts during infection. In order to analyze the genetic stability of TcpF and TcpC, we sequenced the Tcp gene locus of 68 UTI E. faecalis isolates and 20 UTI E. coli isolates. Both locus rearrangements by inversion and transposition and more frequent single nucleotide polymorphisms in the TcpF gene compared to TcpC support the hypothesis that selection is ongoing and that the sequence was acquired recently in the genome of E. faecalis. Stimulation of RAW264.7 macrophages with E. coli BL21 expressing TcpC, TcpF and TcpM led to suppression of IL-6 and TNF-a production, whereas the TcpF deletion mutant E. faecal-is Symbioflor 1 produced an elevated TNF-a response upon infection compared to the isogenic wild-type strain. The impact of TcpC, TcpF and TcpM on TLR2 signaling was analyzed in transiently transfected HEK293 cells by monitoring the effect on the TLR2-dependent NFĸB activation. All three bacterial Tcps suppress TLR2-depend NF?B activation. The superposition of TcpF-TIR and TLR1-TIR reveals considerable similarity between those two structures. In particular, strong similarity was observed at the BB-loop, which has been reported to be part of the TLR1-TIR and TLR2-TIR interaction. Taking together TcpF and TcpM are new Gram-positive members of bacterial Tcps. Via its TIR domain bacterial Tcp are able to modulate host immune responses by molecular mimicry. Due to Tcps ability to negatively modulate NFĸB activation new therapeutic strategies concerning infectious and non-infectious inflammatory diseases may be de-veloped.