Reactive oxygen species (ROS) and lipid metabolism in idiopathic pulmonary fibrosis - role of peroxisomes in the pathogenesis of this devastating disease

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic devastating disease, and its pathogenic mechanisms remain incompletely understood. In this disease, the lung undergoes dramatic pathological remodelling and myofibroblasts with high alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA) content secrete huge amounts of extracellular matrix. However, altered peroxisome functions in IPF pathogenesis have never been investigated. Proinflammatory mediators and reactive oxygen species (ROS) accumulation were shown as pathogenetic mechanisms of this yet incurable disease. Since peroxisomes are involoved in both the degradation of proinflammatory lipid mediators (eicosanoids) as well as ROS metabolism, alterations in the protective capacity of this organelle might contribute to the pathogenesis of IPF. In addition, children with Zellweger Syndrome, the most severe peroxisomal biogenesis defect, develop chronic liver fibrosis and cirrhosis, suggesting that the peroxisomal metabolism is essential for the protection against fibrotic organ degeneration. In the experimental part of this thesis the hypothesis was tested, 1) whether the peroxisomal compartment and corresponding gene expression is altered in IPF, 2) whether the downregulation of peroxisomal biogenesis and metabolism in IPF promotes further excessive secretion of extracellular matrix proteins and proinflammatory mediators and 3) whether proinflammatory and profibrotic cytokines influence peroxisomal abundance and metabolism. Moreover, the molecular mechanisms leading to the alterations of the peroxisomal compartment were investigated. In addition, a bleomycin induced lung fibrosis mouse model was used to analyze peroxisomal biogenesis, antioxidative and lipid metabolic proteins at various time-points after bleomycin treatment. The molecular mechanisms and specific involvement of peroxisomal proteins in TGF-beta1 induced ECM production were investigated. Finally the effect of TGF-beta1 on the peroxisomal compartment in TGF-beta receptor II knockout (TbetaRII) and Smad3 knockout mice as well in transgenic constitutively active TbetaRICA overexpressing mice was studied. In this thesis, the peroxisomal compartment as well as peroxisomal metabolic proteins were analyzed in parallel to several cell type-specific markers in paraffin sections of different lung tissue samples of human controls in comparison to IPF patients. In addition, primary cultures of lung fibroblasts of the same individuals were used for morphological, biochemical and molecular biological analysis of peroxisomal protein alterations. Moreover, control and IPF fibroblast were challenged with TGF-beta1,TNF-alpha, IL-6 and PEX13 siRNA to analyze the impact of peroxisomes on the molecular pathogenesis of IPF. To confirm this in vitro findings the bleomycin induced lung fibrosis mouse model and TßRII mice were used to study peroxisome biogenesis and metabolism in situ in these animal models. By comparing peroxisome-related protein and gene expression in lung tissue and isolated lung fibroblasts between human control and IPF patients, we found that IPF lungs exhibited a significant down-regulation of peroxisomal biogenesis and metabolism (e.g. PEX13p, catalase, ABCD3 and acyl-CoA oxidase 1). Moreover, in vivo the bleomycin-induced downregulation of peroxisomes was abrogated in TßRII mice indicating a role for TGF-beta1signaling in the regulation of peroxisomes. Furthermore, in vitro treatment of IPF fibroblasts with the pro-fibrotic factors TGF-beta1 or TNF-alpha was found to downregulate peroxisomes via the AP-1 signaling pathway. Therefore, the molecular mechanisms by which reduced peroxisomal functions contribute to enhanced fibrosis were further studied. Direct down-regulation of PEX13 mRNA by RNAi 1) induced the activation of Smad-dependent TGF-beta signaling, accompanied by increased ROS production, 2) resulted in the release of cytokines (e.g. IL-6, TGF-beta) and excessive production of collagen I and III. In contrast, treatment of fibroblasts with ciprofibrate or WY14643, PPAR-alpha activators, induced peroxisome proliferation and reduced the TGF-beta-induced myofibroblast differentiation and collagen protein in IPF cells.Overall in this thesis it could be proven that the peroxisomal compartment is severely affected and compromised in IPF, mediated by TGF-beta1 signaling and the action of proinflammatory cytokines (TNF-alpha and IL-6) via AP-1 signal transduction. TGF-beta1 downregulates peroxisomes via the Smad-dependent pathway, which results in reduced ability of cells to scavenge ROS, degrade proinflammatory lipid mediators (eicosanoids) and subsequently inducing a vicious cycle, leading to the aggravation of IPF. Thus, TGF-beta1 and TNF-alpha may exacerbate the clinical conditions and intensify the fibrotic response in patients with IPF upon inflammation and lung injury by the downregulation of peroxisomal biogenesis and metabolism (e.g. PEX13, ACOX1). Die Ideopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine schwerwiegende chronische Lungenerkrankung, deren Pathomechanismus bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt wurde. Im Verlauf dieser Erkrankung wird die Lungenstruktur dramatisch pathologisch umgebaut und Myofibroblasten mit einem hohen Gehalt an a-glatten Muskelzellaktin (a-SMA) sezernieren riesige Mengen extrazelluläre Matrix. Die Ansammlung von proinflammatorischen Mediatoren und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist bisher als pathogener Faktor dieser nach wie vor unheilbaren Krankheit, nachgewiesen worden. Da Peroxisomen sowohl in den Abbau von proinflammatorischen Lipidmediatoren (Eicosanoide) als auch in den ROS-Stoffwechsel eingebunden sind, könnten Veränderungen der peroxisomalen Schutzfunktion zur molekularen Pathogenese der IPF beitragen. Weiterhin entwickeln Kinder mit Zellweger Syndrom, den schwersten Phänotyps der peroxisomalen Biogenese Defekte (PBD), chronische Leberfibrose bzw. Zirrhose, was für die essentielle Bedeutung des peroxisomalen Stoffwechsels zum Schutz vor fibrotischen Organveränderungen spricht. Im experimentalen Teil dieser Dissertation wurde geprüft, 1) ob das peroxisomale Kompartiment und die dazugehörige Genexpression bei IPF verändert ist,2) ob die Herrunterregulierung der peroxisomalen Biogenese und des peroxisomalen Stoffwechsels die Sekretion extrazellulärer Matrixproteine und inflammatorische Mediatoren steigert und 3) ob proinflammatorische und profibrotische Zytokine die Anzahl Peroxisomen und deren Stoffwechsel beeinflussen. Außerdem wurden die molekularen Mechanismen, die zur Veränderungen des peroxisomalen Kompartiments führen, untersucht. Zusätzlich wurde ein Bleomycin-induziertes Lungenfibrose-Mausmodell benutzt, um die peroxisomale Biogenese sowie Proteine des antioxidativen Stoffwechsels des Lipidmetabolismus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bleomycinbehandlung zu analysieren. Weiterhin wurden die Mechanismen und die spezifische Beteiligung peroxisomaler Proteine bei der TGF-ß1 induzierten Produktion extrazellulärer Matrixkomponenten untersucht. Zuletzt wurde der Effekt von TGF-ß1 auf das peroxisomale Kompartment in TßRII-, und SMAD3- Knockoutmäusen, sowie in transgenen TßR-I überexprimierenden produzierenden Mäusen (TßRICA), beobachtet. In dieser Dissertation wurden das peroxisomale Kompartment und peroxisomale Stoffwechselproteine parallel zu zelltyp-spezifischen Markern in Paraffinschnitten von verschiedenen Lungengewebsproben von gesunden Kontrollen und IPF Patienten analysiert. Zusätzlich wurden Primärkulturen von Lungenfibroblasten von Kontrollen und IPF Patienten benutzt, um sie morphologisch, biochemisch und molekularbiologisch auf peroxisomale Veränderungen zu untersuchen. Weiterhin wurden Primärkulturen von gesunden und IPF Patienten mit TGF-ß1, TNF-a, IL-6 und PEX13 siRNA behandelt, um den Einfluss von Peroxisomen auf die molekulare Pathogenese der IPF besser zu verstehen. Um die in vitro Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Biogenese und der Stoffwechsel in der Peroxisomen in situ in Wildtyp Mäusen mit Bleomycin induzierten Lungenfibrose im Vergleich zu TGF-ß Rezeptor II Knockoutmäuse (TßRII) untersucht. Beim Vergleich peroxisomen-assoziierter Protein-und Genexpression in Lungengewebe und isolierten Fibroblasten gesunder Kontrollen und IPF Patienten fiel auf dass die Biogenese und der Stoffwechsel der Peroxisomen signifikant herunterreguliert wurden (z.B. PEX13p, Katalase, ABCD3 und Acyl-CoA-Oxidase 1). Ferner wurde die Bleomycin-induzierte Herunterregulierung der Peroxisomen in TßRII Knockoutmäusen aufgehoben, was auf eine wichtige Rolle von TGF-ß auf die Regulierung der Peroxisomen hinweist. Zusätzlich wurde nach Behandlung mit den profibrotischen Faktoren, TGF-ß1 oder TNF-a in IPF Fibroblasten eine Herunterregulierung der Peroxisomen durch den AP-1 Signalweg beobachtet. Deswegen wurden die Mechanismen, duch die eine Verringerung der Peroxsiomen zu vermehrten Fibrose beitragen, im Detail untersucht. Eine direkte Herunterregulierung der PEX13 mRNA via RNAi 1) induzierte die Aktivierung des Smad- abhängigen TGF-ß Signalwegs und wurde begleitet von einer gesteigerten ROS-Produktion, 2) resultierte in der Freisetzung von Zytokinen (z.B. IL-6, TGF-ß1) und der übermäßigen Produktion von Kollagen I und III. Im Gegensatz dazu führte eine Behandlung mit Ciprofibrat oder WY14643, beides PPAR-a-Aktivatoren, zu einer Proliferation der Peroxisomen und der reduzierten TGF-ß-induzierten Myofibroblastendifferentiation, sowie zu verringerten Kollagenmengen in IPF-Zellen.Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation nachgewiesen werden, dass Peroxisomen bei der ideopathischen Lungenfibrose stark verändert und beeinträchtigt sind, und dieser Prozess durch TGF-ß1 und dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-a und IL-6) mittels der AP-1 Signaltransduktion ausgelöst wird. TGF-ß1 reguliert Peroxisomen mittels des Smad-abhängigen Signalwegs herunter, was in einer verminderten Fähigkeit, zu intrazellulären ROS-Abwehr mündet. Zusätzlich werden proinflammatorische Mediatoren (Eicosanoide) nicht mehr abgebaut, was in einen Teufelskreis mündet und zur Verschlechterung der ideopathischen Lungenfibrose führt. Somit scheinen TGF-ß1 und TNF-a zur Exazerbation der klinischen Symptome und der verstärkten Fibrose von IPF Patienten durch die Herunterregulierung der peroxisomalen Biogenese und des peroxisomalen Stoffwechsels (z.B. PEX13, ACOX1) beizutragen.