Kopplungsanalyse und Kandidatengenansatz auf Chromosom 14 zur Identifikation des ursächlichen Gens in einer Familie mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA)

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mutation, die in einer siebenköpfigen konsanguinen Familie (Eltern, drei Söhne, zwei Töchter) zur Erkrankung des jüngsten Sohnes an einer Leberschen kongenitalen Amaurose (LCA) geführt hatte, mithilfe einer genomweiten Kopplungsanalyse zu identifizieren.Durch Single Nucleotide Polymorphism-(SNP)-Kopplungsanalysen wurden mögliche Kopplungsregionen auf Chromosom 7, 8 und 14 identifiziert. Da in der Familie nur ein Kind betroffen war und nur DNA-Proben des Betroffenen, der Geschwister und der Eltern verfügbar waren, konnte nur eine verhältnismäßig geringe Zahl der Meiosen in die Logarithmic Odds Ratio-(LOD)-Score-Berechnung für diese Regionen mit einbezogen werden. Daher wurden diese Bereiche mithilfe von Mikrosattelitenmarker genauer untersucht.Durch die SNP-Kopplungsanalyse sowie durch die Kopplungs- und Haplotypenanalyse der Mikrosatellitenmarker konnte auf Chromosom 14 ein Kandidatenlocus für den gesuchten Gendefekt eingegrenzt werden. Die anhand ihres Expressionsmusters bzw. ihrer Funktion ausgewählten Kandidatengene tubulin polymerization-promoting protein family member 2 (TPPP2), retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1 (RPGRIP1), defender against cell death 1 (DAD1) und neural retina leucine zipper (NRL) wurden genauer betrachtet. Die Sequenzierung von RPGRIP1 führte bei dem erkrankten Kind zur Identifizierung zweier bekannter Mutationen. Hierbei handelte es sich um eine homozygote Nonsense-Mutation in Exon 9 (c.1111C>T; p.R371X) und um eine heterozygote Missense-Mutation in Exon 18 (c.3097G>C; p.Q1033E).Da in der Familie von einem autosomal-rezessiven Erbgang auszugehen war, bestätigte das Segregationsverhalten der Nonsense-Mutation in Exon 9 (beide Eltern und drei Geschwister waren heterozygote Träger, phänotypisch aber gesund) diese als Ursache der Erkrankung.Die Kopplungsanalyse ist beim Vorliegen eines ausreichend großen Stammbaums und bei der Verfügbarkeit von DNA-Proben der Familienmitglieder eine valide Technik zur Identifikation von krankheitsassoziierten Allelen. Allerdings ist die in der vorliegenden Arbeit verwendete Strategie (SNP- und nachfolgende Mikrosatellitenanalyse) in Zeiten der Hochdurchsatzsequenzierung und des Whole Exom Sequencings (WES) veraltet. Das WES liefert valide Ergebnisse und kann auch beim alleinigen Vorliegen der Patienten-DNA eingesetzt werden. Auch eine kostengünstige Paneldiagnostik, die gezielt Gene mit bekannter Assoziation zu Netzhautdegenerationen untersucht, hat im Fall der LCA eine Nachweisquote von mindestens 80 %. The fundamental idea of this work was to identify the mutation, which inside a seven-headed consanguine family (parents, three sons, two daughters) was the cause of Leber´s congenital amaurosis (LCA) disease of the youngest son, using a genome-wide linkage-analysis.Possible linkage regions were identified through Single nucleotide polymorphism-(SNP)-based linkage-analysis on chromosome 7, 8 and 14.Because only one child was affected and only the DNA-samples of the affected child, of the siblings and of the parents were available, only a comparatively low number of meiosis could be included in the logarithm odds ratio-(LOD)-score calculation. Therefore these regions were testet with a microsatellite marker-based linkage-analysis.The combination of SNP-based linkage-analysis and microsatellite marker-based haplotype- and linkage-analysis specified a region on chromosome 14 as the candidate locus for the gene defect.Bases on their cell-type specific expression and/or on their function tubulin polymerization-promoting protein family member 2 (TPPP2), retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1 RPGRIP1, defender against cell death 1 (DAD1) and neural retina leucine zipper (NRL) were selected as candidate genes. The sequencing of RPGRIP1 identified two well-known mutations inside the genome of the affected child: one homozygous nonsense-mutation in exon 9 (c.1111C>T; p.R371X) and one heterozygous missense-mutation in exon 18 (c.3097G>C; p.Q1033E).Because of the assumption of an autosomal recessive succession inside the family, the segregation of the nonsense-mutation in exon 9 (both parents and three siblings were heterozygous carriers but phenotypic unaffected) confirmed this mutation as the cause of the disease.The linkage analysis is a valid technology for the identification of disease-related alleles, if an adequate large family-tree and DNA-samples of family-members are available. However the strategy used in this work (an SNP- followed by microsatellite-analysis) is rather outdated in times of high-throughput-sequencing and whole exome sequencing (WES)The WES provides valid results while being more cost efficient and can be used, if only the DNA of the patient is available. Moreover a cost efficient panel-diagnosis, examining genes with a well-know association to retinal degeneration, shows in case of LCA at least an 80 % detection-rate.