Charakterisierung der Promotorregionen von Flotillin-1 und Flotillin-2

Abstract

Die Flotillin-Familie besteht aus zwei evolutionär hochkonservierten Membranproteinen, die in verschiedenen Organismen ubiquitär exprimiert werden. Flotilline sind mit Membranmikrodomänen mittels Lipidmodifikationen und Oligomerisierung assoziiert. Da Flotilline N-terminal eine s.g. SPFH-Domäne besitzen, gehören sie zusammen mit Stomatin, Prohibitin und Hf1K zur SPFH-Familie. Am C-Terminus der Flotilline befinden sich mehrere Glutamat- und Alanin Wiederholungen, welche vermutlich Coiled Coil-Strukturen bilden und für die Oligomerisierung wichtig sind. Durch Stimulation mit EGF können Flotilline an Tyrosinresten phosphoryliert werden. Flotilline spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Mechanismen wie bei der Wachstumssignaltransduktion, der Insulinsignalkaskade, Phagozytose, der Regulierung des Aktinzytoskeletts und dem Membrantransport. Hingegen ist bisher nicht viel über potentielle Transkriptionsfaktoren, Effektoren und Inhibitoren der Flotillinexpression bekannt.In dieser Arbeit war es daher das Ziel, die Promotorregionen der Flotilline näher zu charakterisieren. Hierfür wurden zunächst biometrische Sequenzvergleiche durchgeführt unterschiedlich große Promotorregionen der Flotilline in Form von Deletionskonstrukten in einen Reportergenvektor kloniert und diese Konstrukte anschließend in HeLa-Zellen transfiziert. Um unterschiedliche Effekte verschiedener, äußerer Einflüsse zu untersuchen, wurden die transfizierten Zellen mit EGF, PMA oder dem MEK1/2-Inhibitor UO126 behandelt. Die Aktivität beider Promotoren ließ sich durch EGF und PMA steigern, wobei PMA den stärksten Effekt erzielte. Die basale sowie die EGF-induzierte Promotoraktivität wurden mittels MEK1/2-Inhibitor UO126 gehemmt, was darauf hindeutete, dass die Transkription der Flotilline durch die MAPK-Kinase ERK1/2 reguliert wird.Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse lassen vermuten, dass eine bestimmte Anzahl von Basen in den Promotorregionen vorhanden sein muss, um ein bestimmtes Aktivitätsniveau zu erreichen. Zusammenfassend sprechen diese Resultate dafür, dass sich innerhalb der hier untersuchten Promotorregionen wichtige genregulatorische Sequenzen befinden, welche die Expression der Flotilline beeinflussen und durch verschiedene externe Signale moduliert werden können. The family of the flotillins encounters two highly evolutionary conserved membrane proteins, which are ubiquitary expressed among different organism. Flotillins are associated with membrane microdomains via lipid-modification and oligomerisation. With an n-terminal SPFH-domain, flotillins belong together with stomatin, prohibitin and Hf1K to the SPFH-family. On the c-terminus of the flotillins are several glutamate and alanine repeats, forming coiled-coils and enable oligomerisation. EGF-stimulation of flotillins enables a phosphorylation of the tyrosins. Flotiilins play a major role in different physiological mechanisms e.g. growth signal transduction, insulin signaling, phagocytosis, regulation of the actin cytoskeleton and transport along the membrane. Nevertheless not many details are fully elucidated when it comes to potential transcription factors, effectors and inhibitors of the flotillin-expression.In this thesis, the primary aim was therefore, to depict a better characterization of the promoter region of the flotillins. With the help of biometric sequence alignments of different sized promoter regions of the flotillins, I was able to introduce those deletion-constructs into a reportergen vector, which were later on transfected into HeLa-cells. During the next step of my experiments, I exposed those cloned and later transfected cells to EGF, PMA or the MEK1/2 inhibitor UO126.The activity of the promoter was raised by exposure to EGF and PMA, whereas PMA had the most powerful effect. The basal and the EGF-induced promotor activity were inhibited using the MEK ½ inhibitor UO126. Those results point towards that the transcription of the flotillins is regulated by MAPK kinase ERK ½.Furthermore, I showed that a specific number of bases in the promoter region were necessary to enable a specific level of activation.Altogether these findings suggest an important genregulatory sequence in those promoter regions that were further investigated in this thesis, which can have a tremendous effect on the expression of the flotillins, being modulated by external signals.