Untersuchungen am caninen Modell für frühkindliche Netzhautdegeneration nach erfolgreicher Gentherapie mit verschiedenen AAV-Vektoren

Abstract

Die frühkindliche Netzhautdegeneration (EOSRD) ist eine seltene Erkrankung, die mit schweren visuellen Einschränkungen innerhalb der ersten 2 Lebensjahre verbunden ist und zu einer vollständigen Erblindung noch vor dem 20.Lebensjahr führen kann. Als Ursache wurde u.a. das Gen RPE65 identifiziert. Im Hundemodell führte das Einschleusen einer korrekten Kopie des mutierten Gens in das retinale Pigmentepithel (RPE) im Rahmen Adeno-assoziierter Virus (AAV) vermittelter Gentherapie erfolgreich zur Wiederherstellung des Sehvermögens. Die beim Menschen durchgeführten klinische Phase I/II Studien konnten die Sehleistung nur teilweise verbessern. Die Ursache dieser Diskrepanz ist bisher unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des retinalen Gentransfers am caninen Modell zu untersuchen.Es wurden dabei die Retinae von 11 Hunden untersucht: 1 unbehandeltes Tier, 6 Tiere, die das fragliche Protein nach Behandlung mit verschiedenen AAV-Vektoren kontinuierlich exprimieren und 4 Tiere, die durch Expression mit einem Tetracyclin-abhängigem System (Tet-On/Off-System) über die Anwesenheit (Tet-On) oder Abwesenheit (Tet-Off) von Tetracyclin reguliert worden sind. Zur Untersuchung dienten verschiedene Marker, die als Primärantikörper verwendet wurden, um unterschiedli-che Zellarten der Retina darzustellen. Die durchgeführten Untersuchungen konnten weder eine reaktive Gliose durch die subretinale Injektion, noch eine Minderung dieser durch die Therapie feststellen. Erstmalig wurde dies mit dem gleichen Ergebnis auch an Hunden untersucht, die mit dem Tet-On/Off-System behandelt worden sind. Zur Untersuchung des Sprouting Phänomens, also dem Auftreten von Synapsen außerhalb der äußeren plexiformen Schicht, erfolgte die Begutachtung der synaptischen Verbindungen. Dabei konnte durch die Gentherapie kein Effekt nachgewiesen werden. Allerdings wiesen auch die erkrankten Tiere wenig sprouting events auf. Durch die Behandlung zeigte sich eine Zunahme sowohl von S- als auch von L/M-Zapfen. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass die Therapie zur Rückführung der Delokalisation der L/M-Opsine führt. Erstmalig wurde dies auch bei der Therapie mit einem Tet-On/Off-System untersucht und bestätigt. Das Fehlen einer reaktiven Gliose wird durch die bisher vorliegenden klinischen Daten nach erfolgter Gentherapie bei Hunden bestätigt. Bis dato liegen keine histo-logischen Untersuchungen über die Auswirkungen der Gentherapie in Form der reaktiven Gliose bei behandelten Hunden vor, die die hier erbrachten Ergebnisse bestätigten könnten. Die fehlende Minderung bzw. die geringe Anzahl von sprouting events bei den hier untersuchten Tieren, lässt sich durch ihr junges Alter erklären. Der Therapieeffekt auf die Zapfendichte sowie Opsinlokalisation bestätigt die vorhandenen Daten aus der Literatur. Early onset severe retinal dystrophy is a rare disease, which is associated with se-vere visual impairments within the first two years of life and can lead to complete blindness before reaching the age of 20 years. One form is caused by mutations in the RPE65 gene. In RPE65 mutant dogs a single subretinal injection of AAV viral vectors improved visual function. Human clinical trials couldn t show better visual acuity. The reason for this discrepancy is unclear. The aim of this study was to in-vestigate the effects of retinal gene transfer on canine modelRetinae from 11 dogs were used, 1 unaffected dog, 6 dogs treated unilaterally with different AAV vectors carrying the human RPE65 gene and 4 dogs treated with tetracycline-regulatable AAV Vectors. For the analyses different markers were used as primary antibodies for representing diverse cells in the retina. The analysis could not detect reactive gliosis after subretinal injection. This has been examined the first time in dogs treated with tetracycline-regulatable AAV vectors. To examine sprouting, synapses located outside the outer plexiform layer (OPL), synaptic connections were analysed. No effect was detected by gene therapy. But also the affected, non-treated dogs showed only a small number of sprouting events. The treatment with AAV Vectors showed increased numbers of S- and LM-cones. Furthermore the treatment reduces the extent of LM-opsin mislocalization. For the first time this was examined in dogs treated with tetracycline-regulatable AAV vectors.Clinical data from the dogs confirm the absence of reactive gliosis after gene thera-py. So far there are no histological studies about the effect of gene therapy in form of reactive gliosis, which might confirm these results. The lack of reduction or the presence of only a few sprouting events in the examined animals, can be explained by their young age. The therapeutic effect on the cone density and the opsin locali-zation confirmed the existing data from the literature.