Korrelation von Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis (MAP) Infektion mit der Expression von Matrix-Metalloproteinasen und Toll-like-Rezeptoren im murinen Kolon

Abstract

Aufgrund der pathologischen Ähnlichkeiten zwischen Morbus Crohn beim Menschen und Paratuberkulose bei Wiederkäuern wird Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) schon sehr lange als Zoonose-Erreger betrachtet. Epidemiologische und klinische Studien konnten bislang allerdings keine eindeutigen Hinweise auf einen kausalen Zusammenhang zwischen MAP und der Pathogenese des Morbus Crohn liefern. Bei der Erkennung pathogener Bestandteile spielen die Toll-Like-Rezeptoren eine wichtige Rolle, da sie Abwehrzellen aktivieren können, die dann wiederum eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Bei einer Vielzahl inflammatorischer Erkrankungen wurde die Regulation von Matrix-Metalloproteinasen durch Toll-like-Rezeptoren nachgewiesen. Matrix-Metalloproteinasen gehören zu einer Familie membrangebundener, zinkabhängiger, Endopeptidasen mit der Fähigkeit, verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix abzubauen. Sie sind an der Mukosadestruktion, der Inflammations-assoziierten Karzinogenese und der mukosalen Barrierefunktion sowie der Metastasierung beteiligt. Das Ziel dieser Arbeit war die Erforschung der durch MAP stimulierten Expression von Matrix-Metalloproteinasen sowie Toll-like-Rezeptoren in jungen BALB/c-Mäusen mit oraler MAP-Exposition und intraperitonealer MAP-Exposition im Rag2-/--Maus Modell. Eine Rekonstitutions-induzierte Colitis sollte des Weiteren die besondere Betrachtung der Beteiligung von T-Zellen ermöglichen.Die Ergebnisse aus den Versuchen mit oraler MAP-Exposition geben Hinweise darauf, dass eine orale MAP-Exposition zu einer mukosalen Expression mehrerer Matrix-Metalloproteinasen (MMP-2, -7, -9, -13, -14) sowie TIMP-1 und -2 führt. Obwohl eine orale Exposition mit MAP nicht zu makroskopischer Darmentzündung führte, stellen die beobachteten intramukösen Leukozyten-Aggregate zusammen mit der erhöhten TLR-2-, TLR-6-, IL-1beta-, TNF-alpha-, MMP-2- und MMP-9-Expression in MAP-exponierten Mäusen vermutlich einen Teil der Immunantwort gegen MAP dar.Um die Wirkung von MAP in einem gesicherten Infektionsmodell zu beobachten, wurde ein Rag2-/- -Maus-Modell der Rekonstitutions-induzierten Colitis gewählt und die MAP-stimulierte Expression von TLRs und MMPs analysiert.Unsere Versuche zeigten, dass beides, MAP und T-Zellen, für die Induktion einer Entzündung und die Gewebepathologie erforderlich sind. Die Induktion von TNF-alpha, TLR-6 und MMP-9, -13, -14 sowie TIMP-1 wurde nur in Gegenwart von MAP und CD4+CD45RBlo/int T-Zellen beobachtet, nicht unter Einzeleinwirkung. Dies führte zu der Annahme, dass MAP nach seiner Identifikation durch den Organismus in der Lage ist, eine Immunantwort mit proinflammatorischen und gewebezerstörenden Mechanismen, die im weiteren Verlauf wiederum zu einer manifestierten Entzündung führen können. In beiden MAP-Infektionsmodellen konnten mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen MAP-Kolonien lokalisiert und MMP-9 exprimierende Zellen identifiziert werden. Durch diese Untersuchungen wurde ein Infektionsmodell etabliert, das die Analyse der MAP-induzierten Stimulation und der proinflammatorischen Aktivität von CD4+-T-Zellen ermöglicht. Nach einer intraperitonealen Infektion wurden signifikante Anzeichen einer Infektion, Granulombildung in der Leber und Entzündungsreaktionen im Dickdarm beobachtet. Zusätzlich konnten lebensfähige MAP aus entzündetem Gewebe kultiviert werden. Alle Anzeichen einer Inflammation, wie eine Erhöhung des Milzgewichts und Granulombildung in der Leber, konnten mit CD4+-T-Zellen in Verbindung gebracht werden. Unabhängig von den experimentell unterschiedlichen MAP-Infektionswegen, kann MAP als "krankheitsfördernde" Einflussgröße betrachtet werden, die bei bestehender Entzündung einen verstärkenden Faktor darstellt.Unsere Arbeit zeigt neue Mechanismen auf, mit denen MAP entzündliche Reaktionen in Abhängigkeit von T-Zell-Aktivität induziert. Dies führt zu einem besseren Verständnis der Bedeutung von MAP in chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und bietet die Grundlage für weitere MAP-Analysen im Tiermodell. Based on the pathological similarities between CD in humans and Johne´s disease in ruminants MAP has been proposed as a zoonosis since a very long time. However epidemiological and clinical studies have not provided clear evidence of a causal relationship between MAP and the pathogenesis of CD so far. In the recognition of pathogenic components and pathogens, including Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), the Toll-like receptors play an important role, as they can activate immune cells, which then cause an inflammation.In a variety of inflammatory disease the regulation of the matrix metalloproteinases (MMPs) has been demonstrated by TLRs. MMPs belong to a family zinc-dependent, endogenous proteases with the ability to degrade various components of the extracellular matrix (ECM). MMPs are involved in mukosal destruction, inflammation associated carcinogenesis and mucosal barrier function, as well as in metastasis. The aim of this study was the analysis of MAP infection-stimulated expression of MMPs and TLRs in infant BALB/c mice with an oral MAP exposure or Rag2-/- mice model of reconstitution-induced colitis with additional attention to the participation of T- cells.The results from the experiments with the MAP oral exposure provide evidence that oral exposure of MAP performs a mucosal expression of several members of the MMP family. Although only an oral MAP exposure does not lead to macroscopic intestinal inflammation observed intramucosal leukocyte aggregates, together with the increased TLR-2, TLR-6, IL-1beta, TNF-alpha, MMP-2 and MMP-9 activity in MAP exposed mice can probably represent a part of the immune response against MAP.To observe the effect of MAP in another infection method and to elucidate the MAP infection-stimulated expression of TLRs and MMPs in a Rag2-/- mice model of reconstitution-induced colitis is chosen. This experimental set-up makes clear that both MAP bacteria and T-cells are required for the induction of inflammation and tissue pathology. The induction of TNF-alpha, TLR-6, and tissue degrading proteases (MMP-9, -13, -14, TIMP-1) are enhanced only in the simultaneous presence of MAP and CD4+CD45RBlo/int T cells, but not under conditions where only one of the factors is present. This led to the assumption that MAP is able to initiate an immune response that induces a pro-inflammatory and tissue-destructive environment, which might lead to a later manifest inflammation. In both models we were able to identifiy MAP colonies and MMP-9-expressing cells in immunofluorescence stainings.These studies show infection models, which enable the analysis of the MAP-induced stimulation and pro-inflammatory activity of CD4+ T cells. According to a systemic infection, significant signs of infection, granuloma formation in the liver and inflammation in the large intestine were observed. In addition, viable MAP bacteria could be cultured from inflamed tissue as well as the MAP-induced inflammatory potential of T-cell subpopulations are evaluated. All signs of inflammation, such as an increase in spleen weight and granuloma formation in the liver, could be associated with CD4+ T cells (225).Our work shows new mechanisms where MAP induced inflammatory reactions subject to T-cell activity, which ultimately offers a better understanding of the role of MAP in chronic inflammatory diseases and facilitates further investigations of MAP in animal models.