Identification of candidate G protein coupled receptors : role of purinergic receptor P2Y2 in pulmonary arterial hypertension

Abstract

Idiopathic pulmonary arterial hypertension is a progressive, chronic, and usually lethal lung disease of unknown causes with limited therapeutic options. Pulmonary arterial hypertension is characterized by aberrant pulmonary vasoconstriction and abnormal pulmonary vascular remodeling. Several lines of evidence suggest that deregulated GPCRs may represent a key factor in the progression of PAH. Specifically, GPCRs are centrally involved in the pathobiology of PAH. Identifying dysregulated GPCRs in PAH may pave the way to targeting abnormal pulmonary vasoconstriction and remodeling, thereby resulting in options for translational research. Therefore, the purpose of the present study was to identify and analyze both known and orphan GPCRs potentially involved in the development of PAH.An analysis of GPCR expression was performed in laser micro-dissected pulmonary vessels from donors and IPAH patients using a quantitative GPCR high-throughput expression screening system. The quantitative GPCR expression analysis revealed that a large number of GPCRs were upregulated in the pulmonary vasculature of PAH patients, and these included VIPR1, chemokine receptors (CMKLR1, CXCR7, CXCR6), a leukotriene receptor (CYSLTR1), neuropeptide Y receptors (NPY1R, NPY5R), lysophosphatidic acid receptors (LPAR1, LPAR2), an endothelin receptor (EDNRB), a trace amine receptor (TAAR8), a leucine-rich repeat (LGR7), a niacin receptor (GPR109B), and 5 orphan receptors (GPR18, GPR21, GPR97 GPR112, and GPR115). The purinergic receptor (P2Y2) and dopamine receptor (DRD1) were downregulated.Further, the mRNA expression of relevant GPCR hits was analyzed in human PASMCs derived from donors and PAH patients. The qPCR results revealed the upregulation of VIPR1 and LGR7 in PASMCs from IPAH patients. In contrast, P2Y2 and DRD1 were downregulated in the PASMCs of IPAH patients.The potential role of candidate GPCRs in PASMCs was previously determined by siRNA knockdown or ligand stimulation. The proliferation of PASMCs determined using BrdU incorporation assay indicated that the knockdown of GPR115, LGR7, and PTAFR significantly reduced serum-induced PASMC proliferation. On the other hand, the knockdown of P2Y2 did not result in any significant changes in PASMC proliferation. Furthermore, the P2Y2 ligand MRS2768 reduced both PDGF- and serum-induced PASMC proliferation. In addition, MRS2768 limited both serum- and PDGF-induced PASMC migration. The knockdown of P2Y2 by siRNA resulted in a spontaneous increase in PASMC migration under serum-starved conditions. MRS2768 also decreased MMP2 activation in PASMCs. Therefore, MRS2768 and its receptor P2Y2 play significant role in migration. Moreover, upon MRS2768 stimulation, P2Y2 promoted cAMP (a potent vasodilator) production in PASMCs. In addition, MRS2768 activated the cAMP/EPAC-mediated inhibition of RhoA/ROCK1 and reduced the MLC phosphorylation. Due to its role in decreasing MLC phosphorylation, MRS2768 might thereby reduce PASMC asoconstriction.overall, this study implies that more GPCRs are differentially expressed in the pulmonary vasculatures of PAH patients than in those of donors. Most interestingly, P2Y2 might play a key role in pulmonary vascular remodeling by regulating PASMC proliferation and migration. Die Pulmonal Arterielle Hypertonie (PAH) ist eine fortschreitende, chronische und meist tödliche Lungenerkrankung mit unbekannten Ursachen und limitierten therapeutischen Optionen. Die Erkrankung ist durch eine erhöhte pulmonale Vasokonstriktion und einen abnormalen pulmonalen Gefäßwandumbau charakterisiert. Es gibt Hinweise, dass fehlregulierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs: G-protein-coupled receptors) eine Rolle bei der Krankheitsentstehung und dem Verlauf spielen.GPCRs sind maßgeblich an der Pathobiologie der PAH beteiligt. Die Identifikation von deregulierten GPCRs in der PAH könnte helfen, diese abnormale pulmonale Vasokonstriktion und pulmonalen Gefäßumbau (Remodeling) besser zu verstehen und eine neue zielgerichtete Therapie zu ermöglichen. Auf Grund dessen liegt das Ziel heutiger Studien in der Identifikation und Analyse von bekannten, sowie seltenen GPCRs, die potentiell in der Entwicklung der PAH involviert sind.Die Analyse der GPCR-Expression erfolgte in dieser Doktorarbeit mittels eines quantitativen Hochdurchsatzverfahrens in Laser-mikrodissektierten pulmonalen Gefäßen von Donoren und PAH-Patienten. Die quantitative GPCR mRNA Expressionsanalyse zeigte eine Vielzahl von hochregulierten GPCRs in den pulmonalen Blutgefäßen von IPAH-Patienten im Vergleich zu den pulmonalen Blutgefäßen der Donoren. Zu diesen hochregulierten GPCRs zählen: VIPR1 (Vasoactive intestinal peptide receptor), Chemokinrezeptoren (CMKLR1, CXCR7, CXCR6), CYSLTR1 (Cysteinyl Leukotriene receptor 1), Neuropeptid Y Rezeptoren (NPY1R, NPY5R), Lysophosphatidsäure Rezeptoren (LPAR1, LPAR2), EDNRB (Endothelin receptor type B), TAAR8 (Trace amine-associated receptor 8), LGR7 (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor), GPR109B (Niacin receptor 2) und fünf seltene (orphane) Rezeptoren (GPR18, GPR21, GPR97 GPR112, and GPR115). Im Gegensatz dazu fanden wir P2Y2 (purinergic receptor P2Y2) und DRD1 (dopamine receptor D1) herunterreguliert.Im nächsten Schritt wurde die mRNA-Expression von dysregulierten GPCRs in humanen glatten pulmonalarteriellen Muskelzellen (PASMCs: pulmonary arterial smooth muscle cells) von Donoren und PAH-Patienten verifiziert. Die Resultate der qPCR zeigten eine erhöhte Expression von VIPR1 und LGR7, sowie eine verminderte Expression von P2Y2 und DRD1 in PASMCs von PAH-Patienten.Die potentielle Rolle verschiedener GPCRs in glatten Muskelzellen wurden über einen siRNA knockdown oder eine Liganden-Stimulation untersucht. Die siRNA mediierte Ausschaltung (knockdown) von GPR115, LGR7 und PTAFR führte zu einer signifikanten Reduktion der Serum-induzierten Proliferation von PASMCs. Im Gegensatz dazu führte der knockdown von P2Y2 zu keiner signifikanten Veränderung der PASMC-Proliferation. Eine Stimulation mit dem P2Y2 Liganden MRS2768 zeigte hingegen eine Reduktion der Serum-induzierten PASMC-Proliferation. Der siRNA-vermittelte knockdown von P2Y2 in PASMCs erhöhte die Migration, während die Stimulation mit MRS2768 die Migration reduzierte. Eine Erklärung dafür kann die durch MRS2768 reduzierte Matrixmetalloproteinase (MMP) 2 Aktivität sein.Zusätzlich erhöhte die MRS2768-vermittelte P2Y2-Stimulation die cAMP-Produktion und führte über eine EPAC-vermittelte Inhibierung der RhoA/ROCK1 Aktivierung zu einer verringerten MLC-Phosphorylierung. Zusammengefasst lässt sich eine veränderte Expression von mehreren GPCRs in den pulmonalen Gefäßen von PAH-Patienten im Vergleich zu Donoren feststellen. Dabei scheint insbesondere P2Y2 über die Regulation von Proliferation und Migration von PASMCs eine wichtige Rolle für den pulmonalen Gefäßumbau zu spielen.