Laser Capture Microdissection in Paraffin eingebetteter Gewebe als Werkzeug zur Bestimmung des Sialylierungsstatus von ausgewählten Zellpopulationen

Abstract

Sialinsäuren haben mannigfaltige Bedeutungen für den menschlichen Körper. Sie regulieren z.B. Wachstumsprozesse während der Embryogenese, aber sie stehen auch im Zusammenhang mit Tumorwachstum und migration. Bis heute ist es bei Analysen, die die Anwesenheit und die Menge von verschiedenen Sialinsäurespezies betreffen, unumgänglich Komplettorganlysate oder größere Organteile zu verwenden, welche dadurch eine Mischung von verschiedenen Zelltypen beinhalten. Hierdurch ist es nicht oder nur sehr schwierig möglich den Sialylierungsstatus eines genau definierten Bereiches in einem Organ und/oder einem bestimmten Zelltypen zu ermitteln.Die in dieser Arbeit entwickelte Analysestrategie ermöglicht einen hoch sensitiven und reproduzierbaren Weg, um diese Problem zu lösen. Dies gelingt durch den Einsatz der Laser Microdissection, weil sie es erlaubt Analysen gezielt ausgesuchter Bereiche von Zellpopulationen durchzuführen. Verstärkt wird dies durch den Einsatz der DMB-HPLCESI-MS Anwendung, welche ein hilfreiches Werkzeug darstellt, für die eindeutige Identifizierung und Quantifizierung von Sialinsäuren. In dieser Kombination sind nicht mehr als 300 Zellen pro Analyse notwendig, um die häufigste Sialinsäurespezies Neu5Ac zu identifizieren. Sollen jedoch andere seltenere Sialinsäurespezies isoliert werden, müssen wohl deutlich mehr Zellen extrahiert werden, je nachdem wie hoch die Konzentration dieser im betreffenden Gewebe ist.Es war mit der etablierten Methode möglich, eine während der Reifung entstandene Verminderung der Sialylierung einer Niere in einem transgenen Mäusemodell zu entdecken, welche sich auf die Glomeruli beschränkte. Im Gegensatz hierzu war es nicht möglich dies mit kompletten Mäuse Nieren Lysaten derselben Versuchsreihe festzustellen (Weinhold et al., 2012).Die beschriebene Kombination von Laser Microdissection von in Paraffin eingebettetem Gewebe mit der verlässlichen als auch hoch sensitiven DMB-HPLCESI-MS Anwendung kann des Weiteren dafür verwendet werden menschliche Gewebeproben zu analysieren, welche mit klinischen Untersuchungen verbunden sind (zum Beispiel Biopsien). Da viele Proben als in Paraffin eingebettete Gewebe vorliegen und viele pathologische Prozesse wie zum Beispiel Metastasen mit veränderten Sialinsäure Spiegeln einhergehen, bietet sich dieses an. Die beschriebene Methode könnte zur Entdeckung neuartiger Sialinsäure abhängiger Prozesse während pathologischer Vorgänge führen und eventuell zur Identifizierung von Biomarkern, die mit diesen korrespondieren. Sialic acids are involved in several biological processes and are discussed to influence e.g. cell growth in embryogenesis and tumor growth as well as tumor migration. So far, analyses regarding the presence and quantities of different sialic acid species were mostly restricted to complete or bigger compartments of organs consisting of a mixture of different cell types. Thus, the exact sialylation status of a defined area and/or a distinct cell type could not be determined.The methodical approach established in this work provides a highly sensitive and reproducible way to solve this problem, since laser microdissection allows the analysis of defined cell populations. Moreover, online DMB-HPLC-ESI-MS provides a useful tool for the unambiguous identification and quantification of sialic acids. For the detection of the most abundant sialic acid species like Neu5Ac, less than 300 cells are necessary per analysis. However, in the case of sialic acid species existing at exceedingly low quantities, significantly more cells have to be isolated depending on the concentration of the sialic acid residues of interest.Furthermore, it was possible to detect an impaired sialylation during kidney maturation in a transgenic mouse model, which was restricted to glomeruli. In contrast, no differences were observed using whole kidney lysates (Weinhold et al., 2012). The described combination of laser microdissection of paraffin embedded tissue with the robust as well as highly sensitive DMB-HPLC-ESI-MS approach could be a useful tool to analyze human tissue samples associated with clinical records (e.g., biopsies) since such samples are prevalently available as paraffin embedded tissue and a lot of pathological processes like metastasis are discussed to come along with changed sialic acid levels. Thus, the outlined strategy may allow the discovery of novel sialic acid dependent mechanisms during pathological events and possibly also the identification of sialic acids as novel biomarkers.